Применение метода горизонтальной хроматографии при исследовании вещественных доказательств в судебно-биологическом отделении

При судебно-биологической экспертизе следов крови и выделений человека на первом этапе исследования возникают задачи, связанные с установлением природы анализируемых микрообъектов. Для этих целей используется физико-химический метод – хроматография: процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента, обеспечивающий экспрессность, высокую точность и чувствительность анализа. Метод хроматографии в тонком слое сорбента способствует обнаружению крови на предметах без видимых следов (особенно при наличии данных, свидетельствующих о возможном удалении следов), а также обнаружение следов пота, мочи, в том числе при исследовании контролей предметов-носителей.

В судебно-биологическом отделении из существующих разновидностей метода – восходящая, нисходящая, радиальная, горизонтальная – широко применяется горизонтальная хроматография, имеющая бесспорное преимущество: устраняется стекание с пластинки растворителя, следовательно, стабилизируются процессы распределения и абсорбции разделяемых объектов, устраняется размывание детектируемых веществ.

В отделении в качестве камер для разделения используются чашки Петри, что:
· позволяет избегать стекания компонентов подвижной фазы и дает возможность использовать растворители с большей плотностью без замедления скорости их движения в сорбенте;
· значительно повышает чувствительность метода;
· предпочтительнее для микрообъектов (из одной и той же вытяжки из следа можно получить полную о нем информацию, можно определить примесь к крови некоторых выделений, достигается подлинное контролирование предметов-носителей).

Применение метода тонкослойной хроматографии в поисковых реакциях в судебно-биологическом отделении в 2009 – 2011 гг.

В среднем в 23 % поисковых реакций кровь не обнаружена. Общероссийский показатель отрицательной хроматографии крови – 39 %.

Подготовка камер. Применяя в качестве камер чашки Петри, диаметр нижней части которых составляет около 9,5 см, используются хроматографические пластинки малого размера – примерно 5,0 × 7,5 см, на которых длина пробега подвижной фазы составляет 6,0 см. Систему растворителей (универсальный растворитель из смеси бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды в соотношении 4:1:2) помещают в нижнюю часть чашки Петри, высота не должна превышать 2–3 мм. Хроматографическую пластинку осторожно сгибают с одной стороны, чтобы не повредить слой сорбента. С помощью препаровальной иглы производится продольная разлиновка пластинки по количеству объектов плюс контроль (свидетель). Это делается для устранения краевого эффекта, чтобы пятна от нанесенных вытяжек из объектов располагались на одной линии. Номера объектов обозначаются карандашом на линии финиша. В чашке Петри пластинка опирается свободным концом на пробирку. Изогнутый конец погружается в растворитель.

Подготовка объектов. Вытяжки из пятен и контролей предмета носителя готовят при помощи изотонического раствора натрия хлорида, заливая вырезки в пробирках с небольшим избытком. Экстракция производится при температуре +4° в условиях холодильника.

Нанесение вытяжек на пластинку. Существует несколько видов пластин для хроматографии. Они различаются по материалу подложки (ПЭФТ – пленка, алюминиевая фольга), размеру частиц сорбента (от 5–17 мкм на аналитических, до 8–12 мкм на высокоэффективных). Наибольшее распространение, в том числе и в нашем отделении, получили пластины на основе алюминиевой фольги ввиду пластичности и легкости деления.

Учитывая размер высохшего пятна испытуемого объекта на стартовой линии – не более 2,0 мм, вытяжки наслаивают 10–12 раз каплями при помощи тонких капилляров с ровным концом, не прикасаясь к слою сорбента, чтобы не травмировать его. Между вытяжками должно быть расстояние не менее 8 мм. После каждого нанесения производится просушка пластинки при комнатной температуре. Свидетелями являются: при хроматографии крови – 0,01% раствор заведомой крови в изотоническом растворе натрия хлорида; пота – 0,01% раствор серина; мочи – 0,01% раствор мочевины и креатинина или свежая моча. Затем пластинку помещают в сухожаровой шкаф на 15 мин. при t +100° для устранения влияния пероксидазы растительного происхождения.

Учитывая тот факт, что адсорбенты на пластинах при хранении сорбируют влагу и другие вещества, находящиеся в воздухе, при использовании неподготовленных пластин образуется фронт «грязи», мешающий определению веществ. Предварительная подготовка представляет собой разгонку чистым растворителем с последующей сушкой в сушильном шкафу при t +110...+120° в течение 1 часа. Затем пластины хранят в сухом герметичном месте. Подготовленные данным способом пластины не теряют своих свойств до 4 месяцев.

Наиболее распространенным сорбентом является силикагель (гидратированная кремниевая кислота, образованная при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушке образовавшегося золя), он применяется для разделения большинства веществ.

Разгонка. Пластинку помещают в камеру, свободный конец которой опирается о пробирку, изогнутый погружен в растворитель. Разделение проводится до линии фронта примерно в течение 10 минут.

Детектирование. После разгонки пластинка вынимается из камеры и просушивается при комнатной температуре до исчезновения запаха уксусной кислоты. Для определения наличия крови пластинку опрыскивают 10% раствором бензидина в этаноле с уксусной или соляной кислотой (10:1). После подсушивания в течение 3–5 минут пластинку опрыскивают 3% раствором перекиси водорода.

Учет результатов. Невооруженным глазом (визуально) оценивают хроматограмму. Образование недалеко от линии фронта зоны синего цвета различной интенсивности указывает на наличие гемоглобина.

Определение значения Rf разделенных веществ проводят как отношение расстояния, прошедшего веществом, к расстоянию, прошедшему фронтом растворителя Rf = L/Lо). Значение Rf (коэффициента распределения) варьирует в зависимости от ряда факторов: примененного сорбента, состава растворителя, концентрации вытяжки из испытуемого следа. Наличие гемоглобина доказывают путем сопоставления образовавшейся на хроматограмме зоны с зоной свидетеля. Наличие в образце выделений человеческого организма не мешает выделению крови этим методом.

Для пота: подготовка вытяжек из объектов осуществляется таким же образом. Выявлению пота не мешает присутствие в пятне крови, слѐз, слюны, мочи, спермы, гноя, выделений из носа и влагалища. Для свидетеля берется вытяжка заведомого пота на марлевом тампоне, заливается изотоническим раствором натрия хлорида на 18–20 часов. Нанесение на сорбент и разделение производится вышеуказанным способом. Пластинку просушивают до исчезновения запаха уксусной кислоты. В роли детектирующего реагента выступает 1% спиртовой раствор нингидрина, которым производят опрыскивание пластинки, после чего производится проявление путем нагревания в термостате при температуре около +60°. Ближе к линии старта при наличии пота образуются розово-фиолетовые пятна с Rf, соответствующим Rf свидетеля.

Для мочи: этапы подготовки, нанесения и разделения проводят вышеуказанным способом. После просушивания пластинку окуривают парами йода, через 5 минут при наличии мочи проявляется серо-коричневая зона, имеющая величину Rf, равную Rf креатинина. После обесцвечивания пластинки на открытом воздухе в течение 20 минут еѐ опрыскивают раствором парадиметламинобензальдегида, образуется зона желтого цвета, с Rf, равной по величине Rf мочевины. Присутствие в образце пота и других выделений определению мочи не мешают.

Таким образом, метод тонкослойной хроматографии используется как для определения наличия биологических компонентов, в частности крови, так и при работе с предметами-носителями; если при исследовании на этих участках выделяются какие-либо антигены, определяется их происхождение. Уточняется вопрос о присутствии пота (реже – мочи) на кажущихся незапятнанными участках предмета-носителя, при положительном результате – осуществляется поиск чистых участков под контролем хроматографии. Таким образом, не установив природу влияния предмета-носителя на реагенты, можно в последующем неверно истолковать полученные результаты групповой принадлежности следов и, тем самым, ввести в заблуждение следственные органы.