Определение антигена H в пятнах крови и слюны человека фитагглютининами анти-H

Разработанные методики изготовления сывороток, специфичных к антигену Н (0) организма человека сложны, трудоемки, дорого стоят и в ряде случаев недостаточно эффективны вне зависимости от того, используют ли естественные антитела (Я. Пинтера, А. Полашкова) или иммунные (Т.В. Прозоровская, Л.И. Тереза, Е.И. Лескова, К.Е. Завадинская, Р.М. Уринсон). Из отечественных авторов П.Н. Косяков первым осветил вопрос о групповых фитагглютининах, в частности об анти-Н. В настоящее время в ряде серологических лабораторий зарубежных стран (ГДР, ЧССР, ФРГ, США, Великобритания) фитагглютинины анти-Н используют для нужд практики, в частности в практике судебной медицины.

Учитывая определенные преимущества экстрактов анти-Н по сравнению с соответствующими сыворотками, в 1962—1963 гг. мы исследовали образцы семян разных растений, выращенных в СССР, с целью изучения серологических свойств полученных из них экстрактов (прим. — Методику изготовления экстрактов см. в журнале «Суд. мед. эксперт.», 1961, № 3; 1963, № 1.) как в реакции агглютинации, так и в реакции абсорбции агглютининов.

Для целей судебной медицины оказались пригодными семена Cytisus sessilifolius L. (ракитник сидячелистный), Laburnum Watered Dipp. (бобовник Ватерера), Tetragonolobus purpureus Moench. (четырехкрыльник пурпурный). Экстракты из семян других растений (Ulex europaeus, Laburnum alpinum, Cytisus ruthenicus) имели низкий титр при хорошей, специфичности или недостаточную специфичность при высоком титре. Экстракты четырехкрыльиика, имея по сравнению с экстрактами ракитника одинаковые титры по отношению к одним и тем же образцам эритроцитов группы 0, обладают существенно меньшей способностью выявлять антиген Н в эритроцитах групп А] и AiB. Поэтому изучали экстракты только из семян ракитника и бобовника, выращенных в южных областях Европейской части Советского Союза. Фитагглютинины анти-Н стабильны в семенах: исследуя семена урожаев 8 лет, мы не отметили практически существенных изменений гемагглютинирующих свойств полученных из них экстрактов.

Методы серологического использования экстракта анти-Н могут быть разнообразными, что обеспечивается высоким титром его и хорошей специфичностью. Титр по отношению к эритроцитам группы О варьирует от 1:16 до 1:512 в зависимости от метода осуществления реакции агглютинации, вида растения, выраженности антигена Н в эритроцитах данного образца крови. Семена ракитника содержат агглютинин более высокого титра, чем семена бобовника.

Как известно, ограниченная специфичность сывороток анти-0 (И) кладет определенный предел длительности наблюдения за реакцией агглютинации. Фитагглютинины ракитника и бобовника имеют большой запас специфичности. Поэтому, учитывая стабильность свойств фитагглютининов в семенах, нет необходимости определять специфичность свежеприготовленного экстракта.

Удается обнаружить малозначительные различия в серологическом действии экстрактов, изготовленных из семян одного вида растений, произраставших в разных местах. Однако эти различия не больше различий, наблюдаемых у сывороток разных серий, свойства которых отвечают судебно-медицинским требованиям.

Определение антигена Н в жидкой крови

Используют только неразведенный экстракт.

Пробирочный метод. К 3 каплям экстракта добавляют 1 каплю 2% взвеси исследуемых эритроцитов; пробирки встряхивают в штативе; центрифугируют 2 мин. при 1000 об/мин (прим. — Быстрота вращения может быть и меньшей, но обязательно постоянной при всех исследованиях.) и энергично встряхивают в штативе (5—8 раз) до тех пор, пока находящийся на дне пробирок осадок эритроцитов не окажется во взвешенном состоянии. Результаты реакции учитывают при помощи лупы (содержимое пробирок выливают или переносят пастеровской пипеткой на тарелку) или микроскопа (на предметных стеклах под покровными). Учитывая любую степень агглютинации, видимую под 5Х—7Х . Наблюдаемые под микроскопом единичные в поле зрения мелкие агглютинаты, состоящие из 3—4 эритроцитов, не отмечают; такие образцы крови относят к Н-отрицательным. Последняя рекомендация для нужд практики вызвана тем, что эритроциты некоторых лиц, не агглютинирующиеся ни одной сывороткой анти-0 (Н), весьма слабо агглютинируются экстрактами. На то, что это не обусловлено некоторой неспецифичностью экстракта, указывают данные экспериментальных работ М.А. Бронниковой, А.С. Гаркави, Т.М. Масис: иногда антиген Н в крови плодов не выявляется ни сывороткой анти-0 (Н) , ни фитагглютинином анти-Н даже в случаях, когда кровь обоих родителей относится к группе 0. Обосновано предположение, что в эритроцитах всех взрослых людей присутствует антиген Н, хотя бы в виде едва заметных следов.

Метод агглютинации на плоскости (пластинки, тарелки) при помощи экстракта осуществляют точно так же, как и при помощи сывороток анти-0 (Н), анти-М, анти-N. Учитывают любую степень агглютинации, видимую под лупой 5Х—7Х при длительности наблюдения 5—10 мин. и более.

Следует иметь в виду, что пробирочный метод с микроскопическим учетом более чувствителен и надежен. Образец крови, определенный при помощи сыворотки анти-0 (Н) как Н-отрицательный, по отношению к экстракту может быть Н-положительным. Такое несовпадение в результатах исследования, наблюдаемое иногда и в случаях применения сывороток разных серий, обусловливается более высоким титром экстракта и пробирочным методом его использования.

Определение антигена Н в пятнах крови

Выявление антигена Н в пятнах крови и выделений фитагглютининами анти-Н производят абсорбции в количественной модификации общепринятым способом. При выборе величины навески пятна и объема добавляемого экстракта исходят из соотношения 50 мг : 0,3 мл. Длительность абсорбции около 20 часов при 3—10°. Титруют .эритроцитами только группы"0. При титровании, после того как экстракт разведен, реакция агглютинации может быть осуществлена как первым, так и вторым описанным выше методом. Однако, по нашему мнению, наиболее целесообразно применять пробирочный метод с учетом результатов реакции при помощи микроскопа.

Соотношение между объемами экстракта и взвеси эритроцитов влияет на выраженность агглютинации. Поэтому титрование порций экстракта, бывших в контакте с пятном, контрольным участком предмета-носителя, а также контрольное определение титра экстракта нужно осуществлять пипетками, образующими капли одинаковой величины. В каждой пробирке титруемого ряда должно оставаться одинаковое (2 или 3) число капель. Взвесь эритроцитов прибавляют одной пипеткой.

Антиген IT в высохшей крови можно определять только в пятнах. Это обусловлено тем, что кровь, в которой реакцией агглютинации антиген Н экстрактом не выявляется, при высушивании в виде корочек снижает титр на 3—5 ступеней.

Установлено, что различные ткани (шерсть, капрон, шелк искусственный и натуральный, хлопчатобумажная ткань), марля стираная и нестираная (22 образца), бинт стерильный (2 образца) не связывают, как правило, в реакции абсорбции фитагглютинин с титром от 1:12 до 1:256. Два образца марли снизили титр с 1:16 до 1:12. Образцы бумажных изделий (мундштуки папирос, газетная бумага, почтовые конверты) оказывали неблагоприятное воздействие на титр экстракта; мундштуки папирос «Беломор-канал», марки с клеем, сигаретная бумага не изменяли титр. Изучена абсорбционная способность 104 образцов крови разных групп с давностью образования пятен от 2 недель до 5 лет. Оптимальный титр экстрактов для выявления антигена Н крови групп 0, А, В и АВ 1:12 — 1:16. Титровали экстракт в близких разведениях (в 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 раз).

Таблица 1

Результаты реакции абсорбции пятнами крови фитагглютинина анти-Н (ракитник сидячелистный). Агглютинация осуществлена пробирочным методом

Обозначения: ++++ агглютинация, видимая невооруженным глазом; +,± − агглютинация видимая под микроскопом.

Пятна крови группы 0 давностью образования до года, как правило, полностью снимали титр экстракта: агглютинация происходила лишь с неразведенным экстрактом (табл. 1). В крови группы А наилучшей абсорбционной активностью обладали образцы с антигеном А2. Из 30 образцов крови группы В (давность образования пятен 2 ½ года) лишь 2 снизили титр на 1—2 ступени; средняя абсорбционная способность остальных пятен была равна 5 ступеням. В крови группы АВ показатели абсорбции были хуже, чем в других группах. Видимо, абсорбционная способность пятен крови по отношению к фитагглютининам анти-Н убывает в последовательности 0>В>А>АВ. Н-отрицательная кровь (по данным реакции агглютинации) групп А и АВ не снижала титра экстрактов. Однократная «нагрузка» фитагглютининами приводила к потере 1—2 ступеней связывания.

Определение антигена Н в пятнах слюны

Исследованы пятна слюны 56 лиц с разными группами крови (давность образования пятен от 3 дней до 6 месяцев). Выявлено высокое сродство фитагглютининов к антигену Н слюны: более половины образцов слюны «выделителей» (29 из 47) вызывали полное поглощение фитагглютининов с титром 1:128. Лишь 2 образца слюны (группы В и АВ) снизили титр менее чем на 3 ступени (табл. 2).

Пятна слюны «невыделителей» если и изменяли титр фитоагглютинина, то не более чем на 1 ступень. При титре экстракта 1 : 32 пятна слюны 6 «невыделителей» снизили титр на 1 ступень, 3 — на 2 ступени. Эти результаты еще раз подтверждают, что слюна большинства «невыделителей» содержит небольшие порции антигена Н.

На специфический характер связывания фитагглютининов анти-Н с

антигеном Н пятен слюны указывает отсутствие абсорбции с пятнами слюны некоторых «невыделителей», отсутствие абсорбции с пятнами слюны сильных «выделителей», предварительно выдержанной 4—5 дней в жидком состоянии, принципиальный параллелизм между данными реакции абсорбции с использованием экстрактов анти-Н и сывороток анти-0 (Н).

Существенно большее сродство к антигену Н растительных агглютининов по сравнению с сывороточными продемонстрировано также в опытах с последовательным насыщением пятен слюны (сыворотка — экстракт, экстракт — сыворотка) и в параллельных опытах абсорбции пятнами слюны, предварительно разведенной в разное количество раз, экстракта и сыворотки.

Таблица 2

Результаты реакции абсорбции пятнами слюны фитагглютинина анти-Н (ракитник сидячелистный). Агглютинация осуществлена пробирочным методом

Обозначения те же, что и в табл. 1.

Для экспертного выявления антигена Н пятен слюны от лип с разными группами крови, видимо, оптимален титр экстракта 1:32 при условии, что контрольные участки предмета-носителя не оказывают выраженного влияния на экстракт.

Снижение титра абсорбированного экстракта пятном крови или выделения на 3 ступени и более по сравнению с контрольными участками предмета-носителя позволяет сделать экспертный вывод о наличии антигена Н в исследуемом объекте.

Вывод в отношении групповой принадлежности крови (выделения) делают в соответствии с данными Т.М. Масис (прим. — В кн.: Материалы III Всесоюзного совещания судебно-медицинских экспертов, Рига, 1957.).

Выводы

1. Агглютиноген Н эритроцитов не столь слабо выражен, как это можно полагать на основании результатов агглютинации с гетероиммунной сывороткой анти-0 (Н). Однако абсорбционная способность его существенно ниже, чем у агглютиногенов крови групп А и В.
2. Экстракты анти-Н ракитника и бобовника по сравнению с сывороткой анти-0 (Н) обладают рядом преимуществ (высотой титра, хорошей специфичностью и способностью абсорбироваться, стабильностью характеристик, экономичностью) и поэтому могут быть рекомендованы для практического использования в судебнобиологических экспертизах.
3. Фитагглютинины анти-Н сохраняются в семенах без изменения свойств в течение ряда лет. Учитывая простоту техники изготовления экстракта, наиболее целесообразно централизованно снабжать экспертов отобранными, обработанными и проверенными семенами, а не экстрактами.
4. По некоторым свойствам и признакам агглютинины семян ракитника и бобовника приближаются к естественным сывороточным изоагглютининам а и р, а не к гетероиммунным сывороткам анти-0 (Н), анти-А, анти-В. Это сходство выражается в возникновении их без видимого антигенного стимула, вероятном генетическом контроле образования, природной специфичности, отсутствии быстровременных изменений в местах их естественного местонахождения (изоагглютинины в крови, фитагглютинины в семенах) и лучшем (по сравнению с кровью) реагировании со слюной в реакции абсорбции.