Сравнительный анализ методов количественного определения карбоксигемоглобина

Количественное определение карбоксигемоглобина в крови трупа остается весьма актуальным в судебно-медицинской практике. В последнее время общепринятыми являются спектрофотометрические методы исследования. Среди них предпочтение отдается методу, предложенному Фретвурстом и Майнеке (ЖСМЭ № 4, 1961 г.) и методике, разработанной Ленинградским областным бюро СМЭ и кафедрой судебной медицины 1 Ленинградского медицинского института им. И.П. Павлова (ЖСМЭ № 2, 1979 г.).

Нами выполнен сравнительный анализ указанных методов в целях выявления зависимости между концентрацией карбоксигемоглобина в крови трупов людей и погрешностями в определениях, если таковые имеют место.

Для построения соответствующих графиков в качестве контрольного материала использовалась кровь ребенка в возрасте до двух лет, которая принималась за кровь с 0 содержанием карбоксигемоглобина. Измерения проводились на спектрофотометре СФ-26.

I. Определение содержания карбоксигемоглобина по методу Фретвурста и Майнеке

Метод основан на поглощении света раствором гемолизированной крови до и после восстановления оксигемоглобина гидросульфитом натрия. Рассчитывалось остаточное светопоглощение при 0 и 100% содержании СО в крови. При построении калибровочного графика использовались кривые поглощения света восстановленной и невосстановленной гемолизированной крови, не содержащей СО, и этой же крови после насыщения ее до 100%.

Для этого бралась кровь, разведенная 0,1% р-ром аммиака в соотношении 0,5:100. После этого кровь помещалась в кювету с толщиной слоя 1 см и измерялся спектр поглощения при длинах волн от 550 до 590 нм. Далее к 10 мл той же крови добавляли 20—30 мл гидросульфита натрия и 0,1 мл 30% р-ра едкого натра. После тщательного перемешивания измерялась оптическая плотность в том же диапазоне волн и рассчитывалось остаточное светопоглощение. При 0 содержании СО в крови оно равно 25%, максимум раствора восстановленной крови наблюдался при 576 нм.

Для получения раствора карбоксигемоглобина, через приготовленный раствор крови пропускали чистую окись углерода, которую получали с помощью реакции между серной и муравьиной кислотами. Документировались спектры поглощения невосстановленной и восстановленной крови. При этом максимум смещался в коротковолновую область и наблюдался при 570 нм. Остаточное светопоглощение при 100% насыщении крови равно 92,5%. Смещение максимума в коротковолновую область может служить качественной характеристикой присутствия СО в крови.

Раствор крови перед спектрофотометрированием должен быть прозрачным. В противном случае он нуждается в центрифугировании в течение 15 минут при 3—4 тыс. об/мин.

Используя полученные данные остаточного светопоглощения при 0 и 100% насыщении крови СО, строился калибровочный график линейной зависимости содержания СО, к которому применима следующая формула:

CO% = ^(x-А)×100 / _B-A, где

• х — остаточное светопоглощение исследуемого образца;
• А — остаточное светопоглощение при С0 = 0%;
• В — остаточное светопоглощение при СО = 100%.

II. Определение содержания карбоксигемоглобина по методу, предложенному Ленинградским областным бюро СМЭ и кафедрой судебной медицины I Ленинградского медицинского института им. И. П. Павлова

Насыщение крови окисью углерода производилось при определении коэффициентов, которые используются для расчета содержания карбоксигемоглобина в трупной крови. Для вывода коэффициентов брали трупную кровь, не содержащую СО, разводили ее 0,1% р-ром аммиака в соотношении 0,5:100. Раствор помещали в кювету с толщиной слоя 1 см и после добавления 5 мг гидросульфита натрия снимали спектр восстановленного гемоглобина в интервале от 500 до 600 нм. При этом максимум наблюдался при 555 нм.

Для получения спектра поглощения карбоксигемоглобина через приготовленный раствор крови в течение 10 мин. пропускали чистую окись углерода, которую получали с помощью реакции между серной и муравьиной кислотами. Затем в раствор добавляли 5 мг гидросульфита натрия и вновь пропускали окись углерода в течение 5 минут. После этого снимали спектр поглощения карбоксигемоглобина также в интервале от 500 до 600 нм, при этом отмечалось два максимума — при 540 и 570 нм. Кривые восстановленного гемоглобина и восстановленного карбоксигемоглобина пересекались в трех точках, соответствующих волнам 550, 558 и 580 нм., наибольшая же разница в светопоглощении восстановленного гемоглобина и карбоксигемоглобина наблюдалась при длине волны 534 нм. Поэтому для расчета коэффициентов мы пользовались волной 534 нм (Д1) и изобестической точкой 558 нм (Дг).

K₁ = (Д₁/Д₂), К₂ = А - К₁, А= Д₁/Д₂ , где

• Д₁ — оптическая плотность при 534 нм (без насыщения);
• Д₁ — оптическая плотность при 534 нм (после насыщения);
• Д₂ — оптическая плотность в изобетической точке. Расчет содержания карбоксигемоглобина производили по следующей формуле:

X = (Д₁—Д₂×К₁)×100 / Д₂×K₂

Для прибора СФ-26 выведены следующие коэффициенты:

K₁ = 0,79, К₂=0,36.

Параллельно двумя методами было произведено количественное определение содержания карбоксигемоглобина в крови 20 трупов лиц, погибших от отравления окисью углерода. Среди них 15 мужчин в возрасте от 25 до 88 лет, 3 женщины— 18, 58 и 82 лет и 2 детей — 2 и 4 лет. Анализы производились на растворе крови одинаковой концентрации по методу Фретвурста и Майнеке в диапазоне от 560 до 580 нм с интервалом в 2 нм, по методике, предложенной Ленинградским областным бюро СМЭ и кафедрой судебной медицины в диапазоне от 500 до 600 нм.

Мы сочли целесообразным снимать полный спектр, так как при насыщении крови СО более, чем на 50%, появление на спектральной кривой двух пиков является и качественной характеристикой.

Проведенная статистическая обработка дала следующие результаты. По методу Фретвурста и Майнеке: средняя х — 79, среднее квадратичное отклонение δ — 12,8, ошибка (х)—2,96, коэффициент вариации CV —16,3.

По Ленинградской методике: средняя х — 77,2, среднее квадратичное отклонение — 11,8, ошибка (х)—2,7, коэффициент вариации С — 15,3. Критерием достоверности различий (t), наблюдаемых между средними служит отношение разности средних (X₁—Х₂) = Д к их статистической ошибке (mD). Следовательно: X₁ = 79±2,96 Х₂ = 77,2±2,7 Д=1,8. Ошибка разницы m₂ = 2,96² + 2,7² = 4., отсюда tф = 0,45.

Для tф =0,45Р (значение вероятности) = 0,347, что не достигает даже первого порога доверительной вероятности (Р = 0,95). Таким образом, разницу между результатами, полученными двумя методами, следует считать статистически недостоверной. Следует также отметить, что по методике, предложенной исследователями Ленинграда, коэффициент вариации несколько ниже — 15,3 против 16,3 и ошибка — 2,7 против 2,96, что может свидетельствовать о том, что результаты, полученные этим методом, несколько точнее.

Руководствуясь этим соотношением концентрации СО в крови и погрешностью измерений, мы исследовали наш материал, ориентируясь на результаты, полученные именно этим методом. Для этого все показатели концентрации СО в трупной крови были разбиты на 8 групп. Каждая группа подвергалась стандартной статистической обработке. Полученные данные приводятся в таблице № 2. Следует заметить, что никакой закономерности нарастания или уменьшения процента ошибки по мере увеличения концентрации СО не выявлено. Минимальная ошибка наблюдается только при средних (от 40 до 60%) концентрациях СО и равна 0,83%.

Таким образом, проведенные исследования показали, что ошибка между двумя предлагаемыми методами статистически недостоверна и следовательно, выбор методики для работы не принципиален. Наиболее точные результаты могут быть получены при работе со средними концентрациями СО в крови. В остальных случаях на результатах исследований могут сказаться, очевидно, как технические погрешности при разведениях (в случаях с большой концентрацией), так и слишком малое содержание СО в исследуемой крови.

Таблица 1

Результаты статистического анализа сравнительного Определений количественного содержания карбоксигемоглобина в трупной крови

Таблица 2

Изменение ошибки с изменением концентрации СО в трупной крови