Выявление антигенов Lewis в пятнах крови реакцией абсорбции-элюции

Выявление антигенов системы Lewis в следах крови на вещественных доказательствах методом абсорбции агглютининов в количественной модификации сопряжено со значительными трудностями: связывание сывороток анти-Le^a и анти-Le^b контрольными участками вещественных доказательств, необходимость больших и насыщенных следов крови. Кроме того, затруднения часто возникают в связи с различной выраженностью антигена Le(b) в крови различных групп системы АВО. Brendemoen (1949, 1950), Miller и соавт. (1954), Л.К. Аржелас (1962, 1965) отмечают, что сыворотки анти-Le^b значительно лучше выявляют антиген Le(b) в эритроцитах группы 0 и А₂ (так как в этих сыворотках агглютининам анти-Le^b часто сопутствуют и антитела анти-Н) и слабее или вовсе не обнаруживают его в эритроцитах группы A1 и A1B. Считают даже, что антиген A1 как бы препятствует развитию

Le(b) (Delaney). Все это нередко затрудняет установление группы системы Lewis.

Целью данной работы явилось выяснение возможности применения абсорбции-элюции для выявления антигенов Lewis в высохшей крови и изыскание оптимальных условий проведения реакции.

В последнее десятилетие зарубежные и отечественные авторы предложили модификации метола абсорбции-элюции для выявлении антигенов систем АВО. MNSS, Р, Rh. Однако аналогичных работ, посвященных системе Lewis, мы не обнаружили.

Материал и метод

Кровь живых лиц с предварительно установленной Lewis при надежностью высушивали на марле при комнатной температуре. Давность пятен была от 2 дней до 8 месяцев, В реакцию вводили гетероиммунные (козьи) сыворотки анти-Lewis, содержащие неполные антитела, с титром 1:32—1:64.

Предварительно выясняли возможность определения Lewis-принадлежности высохшей крови методом абсорбции-элюции в модификациях, разработанных для систем АВО и MN (Nickolls, Pereira, 1962; Fiori и сотр., 1963).

Для этой цели отобрали 10 образцов крови Le (a+b—) и 10 — Le (а—b+), в каждом из 10 образцов 3 относились к группе 0,3 — к А1, 3 — к В и один — к A1B.

Исследование начинали с подбора стандартных эритроцитов группы 0, содержащих антиген Le(a) и Le(b) с наиболее высокой агглютинационной способности с сыворотками анти-Lea и анти-Leb. После однократного отмывания эритроциты трипсинизировали общепринятым способом

Модификация Nickolls и Pereira выявила антиген Le(a) в четырех образцах кропи, причем отмечалась лишь слабоположительная реакция; все 10 образцов группы Le (а—b+) и 6 — группы Le (a+b—) дали отрицательный результат.

В модификации Fiori и сотр. антигены Le(a) и Le(b) не выявлены ни в одном из 20 образцов.

Таким образом, определение группы системы Lewis в высохшей крови методом абсорбции-элюции в модификации Nickolls и Pereira принципиально возможно. Однако необходимо было отработать все этапы реакции, чтобы сделать метод максимально чувствительным, сохранив его специфичность.

При выяснении оптимальных условий реакции исследовали те же 20 образцов крови групп Le (а+b—) и Le (а—b+).

Установлено, что расщепление материала в фазе абсорбции снижает чувствительность метода. Для фазы абсорбции оптимальная температура 4^°, длительность 3-20 часов. Идентичные результаты отмечены при комбинированной абсорбции (1 час при 18-22° и 2 часа при 4°); необходимо 6 отмываний. Лучшие результаты получены при элюировании на плоскости в 0,1% взвесь трипсинизированных эритроцитов в 3% растворе человеческого или бычьего альбумина. Предварительная фиксация метанолом в течение б мин значительно снижает чувствительность метода. Удлинение фиксации до 10-15 мин приводит к отрицательному результату. Антигены системы Lewis, видимо, нерастворимы в физиологическом растворе хлористого натрия, так как в вытяжках из пятен крови групп Le (a+b—) и Le (a—b+) они не были выявлены.

На основании изложенного выше был отработан следующий вариант реакции абсорбции-элюции: 2—3 нити длиной 2—3 мм из разных участков пятна крови и контрольной марли заливали по отдельности 2 каплями сывороток анти-Le^a и анти-Le^b, содержащих неполные антитела (всего применили по 3 серии упомянутых сывороток. титр которых был равен 1:32—1:64). Абсорбировали 16—20 часов при 4°. После инкубации сыворотку отсасывали, материал шестикратно отмывали охлажденным физиологическим раствором хлористого натрия. Элюцию осуществляли в 1 каплю 0,1% взвеси трипсинизированных эритроцитов в 3% человеческом альбумине. Препараты во влажных камерах помешали в термостат при 52—54° на 30 минут (камеры предварительно прогревали 0,5 часа), затем оставляли во влажных камерах при комнатной температуре 2—3 часа, добавляли 1—2 капли физиологического раствора хлористого натрии и под покровным стеклом учитывали под микроскопом.

Методом абсорбции-элюции в разработанной нами модификации исследовали 34 образца крови групп Le(а—b+) (11 — группы 0,13 — А1. 8 — В и 2— А1В); 10— Le (a+b—) (по 2 образца групп 0, В и А1В и 4 А1) и 16 — Le (а—b—). Независимо от системы АВО антигены Lewis были четко выявлены во всех образцах групп Le (а—b+) и Le (a+b—), неспецифических явлений не наблюдалось.

Описанную модификацию использовали при выполнении 5 судебно-медицинских экспертиз. Исследовали 12 образцов крови лиц, проходящих по делу, и 33 следа крови на хлопчатобумажных, льняных, штапельных и шерстяных тканях. Давность пятен была от 2 недель до 1 года. Большинство следов - мелкие слабо насыщенные пятна. В двух экспертизах размеры пятен позволили использовать параллельно методы; абсорбции в количественной модификации и абсорбции-элюции.

Приводим результаты экспертиз.

1. Па пальто подозреваемого обнаружена кровь человека 0(1) группы. При соблюдении общепринятых параметров реакции абсорбции в количественной модификации (стандартные сыворотки анти-Le^a и анти-Le^b с титром 1:24, абсорбция 20 часов при 4°), выявить антигены системы Lewis не удалось — пятно крови и контрольные участки полностью абсорбировали сыворотки анти-Le^a и анти-Le^b. «Нагрузка» агглютининами (сыворотки использовали в том же титре и объеме) не изменила первоначальных результатов.

При использовании метода абсорбции-элюции в пятне на пальто выявлен антиген Le^b, контрольные участки материи не влияли на сыворотки анти-Le^a и анти-Le^b.

2. У подозреваемого изъята столовая салфетка с пятнами крови человека группы A1(II).

Методом абсорбции в количественной модификации установлено: пятна крови и контрольные участки при развернутом титровании снизили титр сыворотки анти-Le^a на 2 ступени; титр сыворотки анти-Le^b снизился на 4 ступени. Предметы-носители снизили титр сывороток анти-Le^a и анти-Le^b на 2—3 ступени. «Нагрузка» агглютининами устранила влияние контрольных участков предметов-носителей, пятна крови снизили титр сыворотки анти-Le^b на 1—2 ступени поглощения и не влияли на сыворотку анти-Le^a. Группа системы Lewis в пятнах крови не была установлена.

Методом абсорбции-элюции в этих пятнах выявлен антиген Le(b).

Приведенная модификация метода абсорбции-элюции позволила также диагностировать группы системы Lewis в небольших пятнах крови на загрязненных вещественных доказательствах.

При исследовании поверхностных следов крови на ворсистых тканях, требующих предварительного переноса крови на марлю, для получения более четких результатов использовали стандартные сыворотки нескольких серий, а также метод последовательной абсорбции-элюции агглютининов по Н.В. Попову в разработанной нами модификации

Вывод

Разработана модификация реакции абсорбции-элюции, позволяющая выявить антигены системы Lewis в пятнах крови давностью до 1 года (срок наблюдения) сыворотками анти-Le^a и анти-Le^b с неполными антителами (титр 1:32—1:64).

¹ Судебно-медицинская экспертиза, 1972, №3.