Установление видовой принадлежности высохшей крови методом иммунофлюоресценции

Некоторые исследователи (Miki и соавт., 1964; Manunza и Рарра-lardo, 1966; Cavera, 1966) применяли метод иммунофлюоресценции для установления видовой принадлежности высохшей крови, используя в основном экспериментальный материал. В большинстве случаев авторы получили положительные результаты, но до настоящего времени еще не разработана методика, пригодная для целей судебно-медицинской экспертизы. Для решения подобной задачи мы проверили следующие люминесцирующие (флюоресцирующие) сыворотки: а) Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи — против глобулинов человека, кролика, свиньи, курицы, собаки и быка; б) Ленинградского научно-исследовательского института вакцин и сывороток (опытная партия) — против глобулинов человека и лошади. Кроме того, проверили сыворотки, преципитирующие белок человека и рогатого скота, производства Научно-исследовательского института судебной медицины Министерства здравоохранения СССР, меченные по нашему заказу изотиоцианатом флюоресцеина (ФИТЦ) на Каунасском заводе бактерийных препаратов.

Прямой способ окрашивания. Сыворотки использовали для прямого окрашивания; объект инкубировали с люминесцирующей сывороткой, отмывали и учитывали результаты в ультрафиолетовых лучах.

Целью предварительных опытов был подбор оптимальных условий, обеспечивающих получение стабильных специфических результатов. Для этого проверили различные варианты каждого этапа реакции.

1. Фиксация объекта: исследовали образцы крови, не фиксированные и фиксированные ацетоном, метиловым спиртом, раствором мочевины, формалином, а также расщепленные и нерасщепленные нити из образцов крови. 2. Температурный режим: 4, 18—20, 37°. 3. Время инкубации с флюоресцирующими сыворотками: от 10 мин до 5 ч с различными интервалами. 4. Подбор растворов для отмывания объектов: физиологический раствор, дистиллированная вода, забуференный физиологический раствор; выясняли также необходимое число отмываний. 5. Рабочие разведения люминесцирующих сывороток: максимальное исследованное разведение достигало 1:128.

Выяснены следующие оптимальные условия: нефиксированную нить с кровью (длиной 2—3 мм) расщепляют и инкубируют с люминесцирующей сывороткой 45—60 мин при 37°, четырежды отмывают забуференным физиологическим раствором рН 7,2, заключают на предметном стекле в забуференный глицерин и учитывают результаты в УФ-лучах (с помощью люминесцентного микроскопа или люминесцентного осветителя ОИ-18).

Рабочее разведение сывороток для реакции было различным — одни использовали неразведенными, другие — в разведении 1:2, 1:4, 1:8.

Оценка результатов визуальная, по интенсивности флюоресценции (четырехбалльная система).

Специфичность сывороток определяли с 13 образцами крови (на марле) человека и животных (гомологичные и гетерологичные образцы). Большинство сывороток было специфично; некоторые дали положительные результаты с филогенетически близкими животными (антибаранья — с кровью барана и козы), а из меченных ФИТЦ сывороток преципитирующая белок рогатого скота реагировала положительно с кровью быка, козы и барана, преципитирующая белок человека — с кровью человека и зеленой мартышки.

При указанных условиях прямым способом окрашивания исследовали 45 экспериментальных образцов крови (человека, быка, барана, кролика, свиньи, зеленой мартышки, гуся, кошки, утки, собаки, курицы, лошади и козы) на марле. Давность следов была от 1 года до 25 лет. Видовую принадлежность во всех опытах определили правильно.

В зависимости от давности образования следов и их растворимости изменялось оптимальное время инкубации. При давности свыше 10—15 лет оно составляло 2—3 ч.

Следовательно, прямой способ окрашивания позволил определять вид крови в пятнах давностью до 25 лет.

Нередко в судебно-медицинской практике количества крови на объекте недостаточно для постановки реакции преципитации в жидкой среде с 2—3 преципитирующими сыворотками. В связи с этим выясняли возможность определения видовой принадлежности способом последовательной обработки люминесцирующими сыворотками против белков различных видов. Например, нить с кровью человека последовательно инкубировали с антисвиной, антикроличьей и античеловеческой сыворотками, отмывали и учитывали в УФ-лучах. С двумя первыми сыворотками получен отрицательный результат, а с античеловеческой отмечена яркая специфическая зеленая флюоресценция, свидетельствующая о том, что на объекте есть кровь человека.

Таким образом, последовательная обработка позволяет определять видовую принадлежность крови в минимальных следах на предмете-носителе. Этот способ заслуживает внимания и нуждается в апробации на экспертном материале.

С целью уточнения степени надежности и стабильности полученных результатов провели 30 «слепых» опытов с кровью человека и животных (на марле). Видовую принадлежность крови установили во всех случаях.

Непрямой способ окрашивания включает 2 этапа. Объект инкубируют с иммунной нефлюоресцирующей сывороткой, отмывают, инкубируют с люминесцирующей сывороткой, иммунной к глобулинам того вида животного, от которого получена нефлюоресцирующая сыворотка.

На I этапе использовали кроличьи сыворотки, преципитирующие белок человека и животных (производство Научно-исследовательского института судебной медицины). Как и при прямом способе, провели предварительные опыты по подбору оптимальных условий. Оптимальное время инкубации с преципитирующими сыворотками составляло при 37° 20—45 мин.

На II этапе использовали люминесцирующую сыворотку против глобулинов кролика, ее оптимальное рабочее разведение составило 1:8, время инкубации с объектом при 37° — 45—60 мин.

Видовая принадлежность тех же образцов, что и при прямом способе, была установлена правильно.

Специфическая активность преципитирующих сывороток не всегда была одинакова — интенсивность флюоресценции одного и того же объекта с разными сыворотками одинаковой специфичности была различна. Кроме того, при непрямом способе имеет значение частная специфическая активность флюоресцирующей сыворотки по отношению к иммунной преципитирующей.

При исследовании следов крови давностью свыше 10—15 лет продолжительность инкубации с преципитирующей сывороткой увеличивается до 60—90 мин.

Таким образом, установлена возможность определения вида крови в следах на марле как прямым, так и непрямым способом окрашивания.

Исследование экспертного материала. 40 пятен крови на хлопчатобумажной ткани, трикотаже, синтетических, тканях и т. п. (в большинстве случаев брали по одному пятну) обрабатывали прямым способом окрашивания. В 26 пятнах установили кровь человека (интенсивная зеленая флюоресценция с люминесцирующей античеловеческой сывороткой при отсутствии флюоресценции с другими сыворотками). Преципитация в жидкой среде с этими объектами тоже дала ко 2—5-й минуте положительный результат с сывороткой, преципитирующей белок человека.

В 5 экспертизах видовую принадлежность крови не установили ни методом иммунофлюоресценции, ни реакцией преципитации ввиду нерастворимости пятен.

В одной экспертизе методом иммунофлюоресценции выявили кровь человека, в то время как в реакции преципитации с сывороткой, преципитирующей белок человека, получен положительный результат лишь к 45-й минуте после предварительного растирания крови со стекловатой. Это наблюдение интересно в аспекте дальнейшего изучения возможности использования иммунофлюоресценции для определения вида в слаборастворимых пятнах крови.

В 8 экспертизах установление вида было затруднено ввиду яркой зеленой аутофлюоресценции предмета-носителя. Положительные результаты удалось получить лишь после переноса крови на марлю.

Параллельно с прямым способом в 30 случаях применили непрямой способ. В 24 следах определена кровь человека, в 6 вид определить не удалось, так как кровь с синтетических тканей почти полностью удалялась при отмывании.

Обсуждение

Метод иммунофлюоресценции по сравнению с реакцией преципитации в жидкой среде обладает некоторыми преимуществами, имеющими значение для судебно-медицинской экспертизы. Это — значительная экономия необходимого материала и времени, затрачиваемого на исследование, простота техники реакции. Важно и то, что метод иммунофлюоресценции позволяет выявлять локализацию антигена непосредственно на предмете-носителе.

Техника реакции, подбор реагентов и оптимальных условий реакции при прямом способе окрашивания проще, чем при непрямом.

Различия в степени чувствительности этих способов мы не нашли.

Исследование экспертного материала не выявило каких-либо расхождений в результатах, полученных методом иммунофлюоресценции, по сравнению с преципитацией в жидкой среде. Заслуживает серьезного внимания проблема гашения зеленой (или близкой к ней) аутофлюоресценции предметов-носителей.

Следует изучить возможность определения вида крови методом иммунофлюоресценции в слаборастворимых пятнах.

Выводы

1. Предложена оптимальная модификация метода иммунофлюоресценции для определения вида крови в следах на вещественнных доказательствах.
2. Определены преимущества этого метода — экономия материала объекта, выявление антигена непосредственно на предмете-носителе, простота и быстрота проведения реакции.
3. Прямой способ окрашивания имеет ряд преимуществ по сравнению с непрямым.