Определение морфина в крови и моче

Большинство методик доказательства морфина в крови и моче базируется на использовании неспецифичных реакций его обнаружения и определения.

Разработка чувствительных, специфичных химико-токсикологических методов определения морфина в биологических жидкостях связана с большими затруднениями, обусловленными химическими свойствами морфина, физиологическими и метаболическими процессами, протекающими в организме человека, а также значительным сходством в химическом строении, фармакологическом действии и метаболизме отдельных алкалоидов опия (Redmond и Parker, 1963; Woods, 1956; Tetsuo Oka, 1954, и др.).

Трудности доказательства морфина в крови и моче химическими методами обусловлены также необходимостью разработки не только специфичной, но и высокочувствительной методики определения.

Экспериментальная часть

Для качественного обнаружения морфина, извлеченного из крови и мочи, использовали хроматографию в тонком слое силикагеля КСК (120 меш).

Для обнаружения морфина использовали платинохлористоводородный реагент¹.

Спустя 30—60 мин на хроматограммах наблюдали окрашенные пятна на уровне метчика (морфина) при исследовании мочи, не содержащей морфина. Таким образом, платинохлористоводородный реагент неспецифичен и не может быть использован для качественного доказательства морфина в моче без тщательной очистки от экстрактивных веществ.

Специфичными реагентами для обнаружения морфина и его аналогов на хроматограммах являются реактивы Марки и Фреде. Чувствительность реакции по Clarke составляет 0,05 мкг морфина, а по исследованиям Л.М. Власенко (1962) реакцией Марки обнаруживается 0,3 мкг и реакцией Фреде 0,1 мкг морфина. Но реактивы Марки и Фреде не позволяют отдифференцировать морфин от некоторых его аналогов. В этой связи необходимо производить не только очистку, но и отделять морфин от других веществ.

Xроматографическое разделение морфина и его аналогов в тонком слое сорбента.

Приготовление пластинок: 6,1 г силикагеля КСК (120 меш), 0,36 г гипса, 19—20 мл дистиллированной воды смешивали в фарфоровой ступке до получения однородной суспензии, которую равномерно наносили методом «поливки» на стеклянные пластинки размером 13×18 см. После подсушивания при комнатной температуре пластинки активировали в течение 2 ч при 110°. На расстоянии 15 мм от нижнего края пластинки с помощью микрошприца емкостью 10 мкл наносили по 10—20 мкг метанольных растворов морфина, его аналогов и других соединений, вступающих во взаимодействие с реактивами Марки и Фреде. Хроматографирование производили в двух системах растворителей: этанол—диоксан—бензол—аммиак 1:8:10:1 (С-1) и этилацетат —метанол — аммиак 17:2:1 (С-2). Фронт растворителей 13—14 см.

Результаты опытов представлены в табл. 1.

При проведении экспериментов с кровью и мочой человека, к которым были добавлены различные количества морфина, установили, что лучшей является система растворителей, содержащая этилацетат—метанол—аммиак 17:2:1, так как позволяет отделить морфин от балластных и экстрактивных веществ, которые извлекаются из крови и мочи вместе с морфином. Они увлекаются фронтом растворителя и не мешают идентификации морфина.

Таблица 1

Хроматографическое разделение морфина в тонком слое силикагеля КСК

Изолирование морфина из крови и мочи производили эдстраукционным методом. При этом 5 мл крови или мочи смешивали с 8 мл 40% раствора бисульфита натрия, добавляли 15% раствор (для крови) или концентрированную соляную кислоту (для мочи) до 10% содержания. Смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, а затем охлаждали до комнатной температуры. К жидкости добавляли 50% раствор трихлоруксусной кислоты до 7% концентрации. После осаждения белковых веществ через 5—10 мин надосадочную жидкость отфильтровывали в делительную воронку, нейтрализовали раствором аммиака до рН 6,0—7,0, по универсальному индикатору. Жидкость насыщали кристаллическим бикарбонатом натрия (0,5 г на 30 мл жидкости) и экстрагировали смесью бутанол—хлороформ 1:9 (3×20 мл×5 мин). Бутанольно-хлороформные извлечения фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Фильтрат выпаривали в двух фарфоровых чашках при температуре не выше 40°. Остатки растворяли в небольшом объеме смеси бутанол—хлороформ 1:9, раствор в виде пятен наносили на хроматографические пластинки 13×18 см со слоем силикагеля КСК (120 меш) и хроматографировали в системе этилацетат—метанол—аммиак 17:2:1. Одновременно на каждую пластинку в 3 пятна наносили по 10 мкг растворов-метчиков (морфин, героин и кодеин). Время хроматографирования 60—80 мин. После подсушивания хроматограммы проявляли: одну — реактивом Марки, вторую — реактивом Фреде, нанося реактивы равномерным слоем. Хроматографические пластинки с исследуемым остатком проявляли методом наложения на пластинки с реактивами Марки и Фреде и отмечали границы проявившихся зон и окрашиваний.

Результаты опытов представлены в табл. 2.

Граница обнаружения морфина составляет 15 мкг в 5 мл крови и 10 мкг в 5 мл мочи. Разработанная методика позволяет извлекать 83% морфина из крови и 71,3% из мочи.

Разработанный метод изолирования, обнаружения и определения морфина в биологических жидкостях был проверен в опытах на животных.

Таблица 2

Границы обнаружения морфина в 5 мл крови и мочи

Обозначения: (+++) — резко положительная реакция; (++) — положительная реакция; (+-) — слабо положительная реакция; (-) — отрицательная реакция; Н — не найдено.

Трем кроликам внутримышечно ввели раствор хлоргидрата морфина 2 мг/кг, 5 мг/кг и 10 мг/кг веса (из расчета на основание). Перед введением и через 30, 60 и 240 мин после введения морфина у животных отбирали по 5 мл крови. От всех кроликов собирали мочу в течение 4 сут. Мочу и кровь исследовали по описанной выше методике, а количественное определение морфина производили по методике, предложенной В.Ф. Крамаренко (1966). Результаты опытов, представленные в табл. 3, подтвердили достаточно высокую чувствительность экстракционно-хроматографической методики обнаружения морфина в моче.

Таблица 3

Исследование крови и мочи 3 кроликов после внутримышечного введения морфина

Обозначения: (++) — морфин обнаружен на хроматограммах реакциями Марки и Фреде, результат реакций положительный; (+-) — морфин обнаружен на хроматограммах реакциями Марки и Фреде, результат реакций слабо положительный; (-) — результат реакции отрицательный.

Эксперименты, проведенные на животных, указывают на целесообразность определения морфина при исследовании суточного объема мочи, а не крови.

Выводы

1. Разработан метод изолирования, обнаружения и определения морфина в крови и моче человека. Граница обнаружения морфина составляет 15 мкг в 5 мл крови и 10 мкг в 5 мл мочи.
2. Отделение морфина от других алкалоидов опия и производных фенотиазинового ряда обеспечивается хроматографированием в фиксированном слое силикагеля КСК.
3. Полученные экспериментальные данные проверены в опытах на животных.

¹ 1 мл 10% раствора платинохлористоводородной кислоты смешивали в мерной жолбе емкостью 50 мл с 25 мл 4% раствора йодида калия и доводили водой до метки.