Определение групп гаптоглобина дискэлектрофорезом в акриламидном геле

Электрофорез в акриламидном геле получил широкое распространение благодаря ряду преимуществ. Являясь синтетическим препаратом, акриламидный гель имеет постоянный химический состав, прозрачен, пригоден как для щелочных, так и кислых буферных систем, имеет большую фракционирующую способность.

Электрофорезу в акриламидном геле посвящен ряд работ (Ю.Я. Гофман, 1965, 1967; М.О. Тер-Маркарьян, Э.Г. Ларский, 1966; Gervais и соавт., 1967, и др.).

Наиболее результативным вариантом вертикального электрофореза в акриламидном геле, и в частности при определении групп гаптоглобина, является дискэлектрофорез (Г. Маурер, 1971; Hilgermann, и др.).

В методическом письме Главной судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения СССР — «Определение типов гаптоглобина в жидкой крови» (1970) — говорится только о крахмальном геле. Практика показала большую трудоемкость подготовительного гидролиза крахмала. Применение акриламидного геля сводит подготовительные операции до минимума.

Материал и методика. Кровь центрифугировали, полученную сыворотку соединяли с гемоглобином в обычных соотношениях. Применяли серийный прибор для дискэлектрофореза модели 69, «РЕАНАЛ» (ВНР).

Основные растворы. Раствор № 1: 1н. НСl — 48 мл, триса — 36,6 г, тетраметил-этилен-диамида — 0,23 мл, дистиллированной воды до 100 мл при рН 8,9 (для получения 1 н. НСl можно использовать «Фиксанал» с 0,1 г эквивалентным раствором НСl, доводя содержимое ампулы водой до 100 мл). Раствор № 2: акриламида — 28 г, метилен-бис-акриламида — 0,735 г, дистиллированной воды до 100 мл. Раствор № 3: сахарозы — 40 г, 0,01% раствора бромфенолового синего до 100 мл. Раствор №4: персульфата аммония — 0,14 г, дистиллированной воды до 100 мл. Раствор № 5 (электродный буфер): триса — 4 г, глицина — 28,8 г, дистиллированной воды до 1000,0 мл при рН 8,3; перед употреблением электродный буфер надо разбавить в 10 раз дистиллированной водой.

Растворы можно длительное время хранить в условиях холодильника; раствор персульфата аммония готовят каждые 10—14 дней.

Полиакриламид — полимер акриламида и метилен-бис-акриламида, он полимеризуется при добавлении катализатора, для чего необходимо приготовить из основных растворов смесь из 1 объема раствора № 1, 2 объемов раствора № 2, 4 объемов дистиллированной воды и 4 объемов раствора № 4. Таким образом получают 6% «мелкопористый гель». Общий объем полученной смеси необходимо приготовить из расчета 2,5 мл на каждую стеклянную трубку, прилагаемую к прибору, что позволяет одновременно исследовать 12 объектов сывороток.

На специальном штативе, входящем в комплект к прибору, укрепляют исходное количество стеклянных трубок, в которые вводят заданное количество геля шприцем с иглой, опущенной на дно штатива. Для устранения мениска и создания безвоздушности на гель осторожно, не смешивая, наслаивают 0,2—0,3 мл дистиллированной воды. Хорошие результаты дает использование эфира вместо воды: это значительно упрощает наслаивание и исключает разбавление геля. Через 20—30 мин, как правило, наступает полимеризация, при этом граница между гелем и дистиллированной водой (или эфиром, который наслаивают до края трубки) становится заметной. После получения геля резиновые прокладки и конусные кольца удаляют, трубки на штативе фиксируются за счет резьбовых зажимов, обеспечивающих свободное извлечение трубок, из которых энергичным встряхиванием удаляют воду (или эфир). Исследуемую сыворотку с гемоглобином в количестве 0,1 мл соединяют с 0,9 мл раствора № 3 и тщательно перемешивают. Необходимое количество трубок (имеющих заводскую нумерацию) с гелем герметично укрепляют в приборе с помощью резиновых прокладок, конусных колец и резьбовых зажимов так, чтобы незаполненные концы выступали в катодную камеру на одном уровне (2—2,5 см); если необходимо применить их в меньшем количестве, то в неиспользованных гнездах герметично укрепляют пустые трубки на максимальную высоту. Удобнее закрывать неиспользованные гнезда пробками. 0,1 мл сыворотки с раствором сахарозы вводят в трубку на гель и, не допуская смешивания, наслаивают рабочий раствор электродного буфера до края трубки. Буферный раствор с успехом можно заменить эфиром. Затем в катодную и анодную камеры с встроенными угольными электродами заливают по 1 л рабочего буферного раствора и электроды присоединяют к источнику постоянного тока.

Проведение электрофореза. Примерно первые 0,5 ч сила тока не должна превышать 2 мА, затем ее увеличивают до 3—4 мА на каждую трубку с гелем и продолжают электрофорез не более 1,5 ч. За миграцией белка можно ориентировочно следить по уровню четкого диска бромфенолового синего, который имеет наибольшую скорость передвижения.

Извлечение и окраска геля. Предварительно приготовленный 0,2% раствор бензидина в 10% уксусной кислоте разливают в пронумерованные пробирки, соответственно количеству гелевых столбиков (их извлекают, обводя затупленной иглой длиной 10 см со шприцем под давлением воды, вводимой между трубочкой и гелем по спирали). Каждый в отдельности объекты помещают в пробирки с бензидиновоуксусным раствором, добавляют по 0,1 мл пергидроля, тщательно перемешивают, при этом через 1— 2 мин появляются лазурно-голубые кольца фракций гаптоглобина. Затем, не допуская перекрашивания, каждый столбик промывают дистиллированной водой и заливают 7% раствором уксусной кислоты. По мере хранения цвет фракций гаптоглобина переходит в темно-коричневый.

Фотографирование и консервирование объектов. Фотографировать лучше с прямым подсвечиванием через матовое стекло, держа гелевый столбик в положении, близком к вертикальному, в пробирке с 7% уксусной кислотой. Мы применяли портативную фотоустановку типа РДУ с пленкой «микрат»-300. Гель можно также в течение длительного времени хранить в глицерине. Столбики легко высушиваются, но в воде довольно быстро принимают первоначальный вид.

Обсуждение методики. В приготовление, соотношение растворов и методику работы с прибором, изложенные в инструкции, прилагаемой к прибору, внесены изменения, упрощающие метод и сокращающие время исследования: вместо введения бромфенолового синего в электродный буфер краситель добавляли к сахарозе; снизили концентрацию акриламидного геля до 6%; исключили применение «крупнопористого» и «стартового» геля; использовали эфир для полимеризации геля и для предотвращения смешивания буферного раствора с сахарозой; упростили введение сыворотки; при указанной силе тока исключили применение холодильника.

Результаты исследований 100 образцов сывороток с известными группами гаптоглобина совпали, причем фракции гаптоглобина выявлялись более четко, чем при других несущих средах.