О методике определения типов эритроцитарной кислой фосфатазы в жидкой крови

Эритроцитарная кислая фосфатаза (ЭКФ) — фермент, катализирующий гидролиз моноэфиров ортофосфорной кислоты.

Как и ряд других ферментов, ЭКФ обладает генетически обусловленным полиморфизмом (Hopkinson и соавт., 1963, 1967) и ввиду этого имеет значение для экспертизы крови по делам о спорном отцовстве.

Схема фенотипов ЭКФ.

Так, по данным Krüger и соавт. (1968), изолированная вероятность исключения ложно указанного отца по системе ЭКФ составляет 23,41%, по данным Wichmann (1968), — 23,94%.

Изоферменты ЭКФ А, В и С состоят из 2 фракций и в различных сочетаниях дают фенотипы А, В, С (гомозиготные) и ВА, СВ и СА (гетерозиготные). Гомозиготные фенотипы состоят из 2 фракций с различной интенсивностью и электрофоретической подвижностью, а гетерозиготные (за исключением состоящего из 2 фракций СВ) — из 3 фракций (см. рисунок).

Наследование фенотипов ЭКФ контролируется 3 расположенными в одном локусе кодоминантными аутосомальными аллелями Р^а, Р^ь и Р^с.

У негритянского населения США было открыто два редких изофермента ЭКФ: R с фенотипами RA и RB (Giblett и Scott, 1955; Кагр и Sutton, 1967) и D с фенотипом BD (Karp и Sutton, 1967), контролируемые соответственно генами Р^r и P^d.

В последние годы получены данные о «немом» аллеле Р° (Herbich, 1969; Herbich и соавт.; 1970).

Типы ЭКФ в жидкой крови определяют электрофорезом гемолизатов в крахмальном геле с последующей инкубацией электрофореграммы в среде, содержащей специфичный для ЭКФ субстрат — фенолфталеинфосфат (или -дифосфат) или паранитрофенилфосфат, из которых в зонах активности изоферментов ЭКФ высвобождаются соответственно фенолфталеин (ярко-розовая окраска в щелочной среде) или паранитрофенол (желтая окраска).

Hopkinson и соавт. (1963, 1964) выявляли типы ЭКФ горизонтальным электрофорезом в течение 17 ч при 5° и 6 В/см с трис-янтарным гелевым и цитратным электродным буфером (в обоих случаях рН 6,0). Разрезанный по толщине гель инкубировали 3 ч при 37° с 0,005 М раствором фенолфталеиндифосфата натрия в 0,05 М нитратном буфере (рН 6,0), после чего подщелачивали аммиаком для проявления зон высвобождения фенолфталеина.

Radam и Strauch (1966, 1967, 1969) проводили горизонтальный электрофорез в течение 14 ч при 4,9 В/см, применяя разделенные на 2 части электродные ванны, гелевый фосфатный буфер с рН 6,0 и электродный цитратный буфер с тем же рН, причем концентрация его в анодной ванне была 0,4М, а в катодной — 0,1М. Окраску электрофореграмм проводили по способу Hopkinson и соавт.

Reimann и Heidel (1967, 1968), разделяя ЭКФ по методу Radam и Strauch, инкубировали электрофореграммы с 0,67% раствором паранитрофенилфосфата в 0,05М нитратном буфере (рН 6,0).

Karp и Sutton (1967) предложили для изучения типов ЭКФ несколько непрерывных буферных систем, в том числе цитрат-фосфатную с рН 5,9; электродный буфер — 0,245М NaH2PO4 0,15 М трехзамещенного цитрата натрия и 1,86 г Na2-ЭДТА/л буфера; гелевый буфер получают разведением электродного буфера 1:100 дистиллированной водой.

Электрофорез (вертикальный) Karp и Sutton проводили в 10,5% крахмальном геле при 4°, в течение первого часа при 3 В/см, последующие 17 ч — при 11 В/см. Прививки гемолизатов делали не на фильтровальной бумаге, как все упомянутые выше исследователи, а закапывали в стартовые щели смесь равных количеств гемолизата и электродного буфера с 2-меркаптоэтанолом и водой. Неразрезанный гель окрашивали 3 ч при 37° 0,005М раствором фенолфталеиндифосфата натрия в электродном буфере.

В течение нескольких последних лет в Институте судебной медицины и в Научно-исследовательском институте МВД СССР изучают возможность использования системы ЭКФ в судебной медицине.

Ввиду схожести методик, применявшихся в указанных институтах, и полученных результатов итоги исследований излагаются ниже в объединенном виде.

Вначале пытались определять типы ЭКФ способами Hopkinson и соавт., Radam и Strauch. Однако при этом ЭКФ выявлялась на электрофореграммах в виде одного нефракционированного пятна, в некоторых случаях обладавшего «шлейфом» или имевшего гантелевидную форму (тенденция к разделению). Определить тип ЭКФ на таких электрофореграммах было невозможно.

Успеха добились, лишь применив несколько модифицированный нами метод Karp и Sutton. Гемолизаты получали замораживанием при температуре от —22° до —28° осадка трижды отмытых физиологическим раствором эритроцитов капиллярной крови живых лиц и оттаиванием через 48—72 ч при комнатной температуре в течение 1,5 ч до начала электрофореза. Гель (12%) готовили из гидролизованного крахмала фирмы «Biotest». Длина геля 22 см, толщина около 0,9 см. Ширина кюветы (и тем самым геля) в обоих институтах была различна, но это отражалось лишь на количестве образцов крови, исследуемых одновременно.

Использовали непрерывную цитрат-фосфатную буферную систему Karp и Sutton. Сваренный и залитый в кювету гель сразу же помещали в холодильник при 4—6° до момента прививки гемолизатов (не менее 2 ч). Одновременно в холодильник помещали электродные ванны с буфером. Стартовые щели располагали в 7,5 см от катодного конца геля и в 0,5—0,7 см одна от другой. Гемолизаты для прививки наносили на кусочки фильтровальной бумаги. Горизонтальный электрофорез проводили в холодильнике при 4—6°, 12—16 мА и 5—6 В/см в течение 16—18 ч.

Использовали как угольные, так и платиновые электроды. По окончании электрофореза гель разрезали по толщине на слои приблизительно по 0,3 см и инкубировали 3 ч при 37° с 0,005 М раствором фенолфталеинфосфата натрия в 0,05 М нитратном буфере с рН 6,0 (субстратная смесь). Ввиду того, что оптимум рН для ЭКФ находится в пределах 5—6, а рН фенолфталеинфосфата натрия весьма высок (10—11), рН субстратной смеси доводили до 5,8—6,0 добавлением кристаллической лимонной кислоты. По окончании инкубации субстратную смесь удаляли и заливали электрофореграммы 25% раствором аммиака для проявления зон активности ЭКФ.

На электрофореграммах получались четко отграниченные фракции ЭКФ, позволявшие диагностировать типы ЭКФ.

В настоящее время в обоих институтах исследуют типы ЭКФ у жителей Москвы для вычисления встречаемости в данной популяции и генных частот.

Система ЭКФ применена в 5 экспертизах по делам о спорном отцовстве. Однако, несмотря на то что типы ЭКФ были определены с несомненностью, исключить отцовство не удалось ни по ЭКФ, ни по другим системам.