Определение ртути по дитизонату при судебно-химическом анализе органов человека

В 1962 году нами разработан для судебно-химических целей метод определения ртути в органах человека, обладающий достаточной чувствительностью и точностью и позволивший сократить время анализа до 2—4 ч. Недостатками метода являются визуальная оценка окраски колориметрируемого осадка и большая затрата времени на анализ.

Поэтому поставили задачу ускорить процесс разложения тканей и разработать быстрый инструментальный метод определения ртути с поверочной качественной реакцией на ртуть.

Деструкция ткани печени

Применяемый в судебно-медицинских лабораториях метод деструкции тканей органов при анализе на ртуть основан на каталитической реакции разложения азотной кислоты в присутствии серной. Катализатор — этанол. Разложение тканей происходит за счет выделения свободных окислов азота и тепла реакции.

Не изменяя принципа деструкции, мы пытались добиться большей глубины ее и ускорения за счет дополнительного введения окислителей: 42% раствора хлорной кислоты, пергидроля и перманганата калия. Однако получить бесцветный деструктат в короткое время нам не удалось.

Углубления и ускорения деструкции мы достигли, увеличив количество серной кислоты в реакции и введя хлорную кислоту, которая является сильным окислителем в горячих концентрированных растворах. В разбавленных растворах при комнатной температуре она теряет окислительную способность (Ф. Коттон, Дж. Уилкинсон, 1969). Поэтому введенная хлорная кислота в начале деструкции действует как сильный окислитель, а после окончания деструкции остаточное количество ее уже не мешает в дальнейшем определению ртути.

В процессе работы выяснилось, что увеличение количества серной кислоты при деструкции без хлорной кислоты также ведет к ускорению и углублению процесса деструкции, но в меньшей степени.

При использовании в реакции хлорной кислоты и увеличении количества серной кислоты деструктат все же остается окрашенным в желтый цвет, но остаток жира значительно уменьшается — до небольшой пленки на поверхности. Время деструкции сокращается до 20 мин, при этом можно использовать большие навески органов, что позволяет повысить границу определения ртути.

Разработано два варианта деструкции. 1-й вариант. К 20-50 г измельченной печени (или другого органа) добавляли 1 мл этанола, 5 мл воды, 10—15 мл (соответственно навеске) концентрированной азотной кислоты и 20 мл концентрированной серной кислоты небольшими порциями, не допуская бурной реакции с обильным выделением окислов азота. По окончании добавления серной кислоты прибавляли 10 мл 42% раствора хлорной кислоты и нагревали в течение 10 мин на кипящей водяной бане. Добавляли 50 мл кипящей воды и фильтровали в колбу, содержащую 20 мл насыщенного раствора мочевины для связывания свободных окислов азота. Фильтр с остатком промывали 1—2 раза кипящей водой. В остывшей жидкости определяли ртуть.

2-й вариант. Деструкцию производили в тех же условиях, но без добавления хлорной кислоты.

Определение ртути

При исследовании деструктата целесообразно использовать экстракционные реакции на ртуть, позволяющие выделить ртуть из кислого окрашенного деструктата в небольшой объем органического растворителя, что дает возможность сконцентрировать ее и повысить границу определения.

Среди экстракционных реакций для исследования биологического материала на ртуть более 20 лет широко используется дитизон (Е. Сендел, 1964; З. Марченко, 1971).

Достоинством дитизона как реагента на ртуть являются высокая чувствительность (0,01 мкг/мл) и достаточно высокая избирательность. Определению ртути в кислой среде мешают серебро, золото, платина, палладий (Г. Иванчев, 1961), которые, однако, являются исключительно редкими объектами исследования в судебной токсикологии.

Недостатком дитизона как реагента на ртуть является легкая окисляемость его не только в щелочной, но и в кислой среде под влиянием окислителей и прямого солнечного света. При этом образуются продукты окисления дитизона (дифенилкарбодиазон и др.), окрашенные в желтый цвет и растворимые в четыреххлористом углероде и хлороформе. Не только окраска, но и максимум поглощения их (390—470 нм) лежит близко к однозамещенному дитизонату ртути (485 нм).

В связи с этим недостатком для замены дитизона было синтезировано более 70 его аналогов, но ни один из них не нашел такого широкого применения, как дитизон. Используемый в отдельных случаях 1,5-ди-β-нафтилкарбазон не имеет существенных преимуществ перед дитизоном.

Определение ртути в виде дитизоната, как правило, используется для десятков микрограммов ее и менее. Так как при химико-токсикологических исследованиях диапазон определяемой ртути в органах человека сильно колеблется, то мы предварительно проверили на водных растворах возможность экстракции и определения ртути в широком диапазоне (от 1 мкг до 1 мг) методом одноцветной окраски по однозамещенному дитизонату ртути. Экстракцию проводили хлороформом и четыреххлористым углеродом.

Методика. К раствору ртути в 20 мл 4 н. раствора серной кислоты добавляли 10 мл 10% раствора сернокислого гидроксиламина, 5 мл четыреххлористого углерода и 0,3 мл и более раствора свежеочищенного дитизона ¹ при легком встряхивании до получения устойчивого изумрудно-зеленого окрашивания органической фазы. Затем производили энергичную экстракцию в течение 30 с. При изменении окраски органической фазы на желтую или оранжево-желтую отделяли органическую фазу и повторяли экстракцию до получения устойчивого зеленого окрашивания. Экстракты собирали под слой 1 н. раствора трихлоруксусной кислоты, промывали водой, а затем 1 % раствором гидроокиси аммония до получения бесцветной водной фракции. Полученный экстракт дитизоната ртути освобождали от воды отстаиванием в течение 5 мин в темном месте. Измеряли объем экстракта и плотность на фотоколориметре ФЭКН-57 в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм при длине волны 485 нм по отношению к четыреххлористому углероду. Экстракцию хороформом производили так же.

Закону Ламберта — Бера подчиняются концентраций ртути 0,05—5 мкг/мл.

Результаты опытов представлены в табл. 1.

Опыты показали, что ртуть из сернокислых растворов экстрагируется как четыреххлористым углеродом, так и хлороформом достаточно полно при широком диапазоне концентрацией в экстрагируемом объеме — от 0,001 до 2 мг. Затрата времени на экстракцию и определение — от 15 до 30 мин.

Таблица 1

Определение ртути в сернокислых растворах по дитизонату (n= 6)

Экстрагент	Количество ртути (2+) (в мг)	X	Sx	X±Sx	Δxотн (в %)
	0,001	0,0009	0,0001	0,0008—0,0010	11
	0,005	0,0044	0,0003	0,0041—0,0047	16
ССl4	0,010	0,0089	0,001	0,0079—0,0099	11
	0,020	0,0191	0,002	0,0171—0,0201	8,4
	0,200	0,193	0,006	0,187—0,199	3,1
	2,200	1,907	0,12	1,787—2,027	6,3
	0,001	0,0006	0,0001	0,0005—0,0007	17
	0 005	0,0038	0,0007	0,0031—0,0045	13
СНСl3	0,010	0,0083	0,0005	0,0078—0,0088	4,7
	0,020	0,019	0,002	0,017—0,021	8,9
	0,200	0,183	0,013	0,170—0,196	6,0
	2,000	1,800	0,07	1,73—1,87	3,6

Примечание. Здесь и в табл. 2 х — среднее арифметическое; S_x — среднее отклонение отдельного результата; X±S_x — интервал среднего результата; Δx_отн (в %) —вероятная относительная погрешность.

Из литературных данных известно, что при определении ртути в биологических объектах по дитизонату производят предварительное выделение ее из минерализата или деструктата. Мы применили прямую экстракцию ртути из деструктата и определяли ее в виде дитизоната.

Получаемый по разработанной методике деструктат имеет примерно 2—4 н. концентрацию серной кислоты с небольшой примесью хлорной, кислотность его благоприятна для экстракции дитизоната ртути. Отсутствие активных окислителей в деструктате позволяет использовать экстракцию ртути в виде дитизоната для прямого ее определения.

Деструктаты всегда имеют желтую окраску за счет недоразрушен-ных пигментов тканей. Мы проверили экстрагируемость их хлороформом и четыреххлористым углеродом. Деструктаты получили разложением 20 и 50 г печени человека по описанной методике и подвергли экстракции 10 мл хлороформа или четыреххлористого углерода в течение 60 с.

Опыты показали, что четыреххлористый углерод не экстрагирует пигментов тканей, а хлороформ экстрагирует, окрашиваясь при этом в желтый цвет. Для полного удаления экстрагирующихся пигментов достаточно 2—3 экстракций хлороформом по 10 мл в течение 60 с. Предварительными опытами установлено, что из сернокислой среды ртуть хлороформом не экстрагируется.

Определение ртути в печени человека производили экстракцией ее в виде дитизоната как четыреххлористым углеродом, так и хлороформом. Печень предварительно проверяли на отсутствие ртути, накопленной в процессе жизнедеятельности организма.

К 20 г измельченной печени добавляли определенное количества ртути (2+). На следующий день производили деструкцию, как описано выше (в присутствии хлорной кислоты и без нее). Половину деструктата помещали в делительную воронку с усеченным конусом (30°) и производили экстракцию дитизоната ртути четыреххлористым углеродом, во второй половине деструктата экстрагировали его хлороформом.

При экстракции дитизоната ртути хлороформом деструктат предварительно встряхивали с 10 мл хлороформа в течение 10 с. Окрашенный в желтый цвет экстракт отбрасывали и повторяли экстракцию хлороформом до получения бесцветного экстракта. После этого производили экстракцию дитизоната ртути хлороформом, как описано выше.

Таблица 2

Определение ртути по дитизонату в 20 г печени (n=6)

Экстрагент	Добавлено ртути (2+) (в мг)	X	Sx	X±Sx	Δxотн (в %)
ССl4	0,005	0,0049	0,0008	0,0041—0,0047	14,7
	0,010	0,0095	0,0017	0,0078—0,0112	14,7
	0,020	0,0190	0,0015	0,0175—0,0205	6,3
	0,200	0,192	0,013	0,179—0,205	5,7
	2,000	1,846	0,182	1,664—2,028	8,2
СНСl3	0,005	0,0045	0,0007	0,0038—0,0052	18
	0,010	0,0085	0,0009	0,0076—0,0094	8,2
	0,020	0,0175	0,0015	0,0160—0,0190	7,5
	0,200	0,186	0,011	0,175—0,197	4,9
	2,000	1,874	0,150	1,724—2,024	6,9

 

Результаты опытов представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что ртуть в печени определяется при экстракции дитизоната ее четыреххлористым углеродом так же, как при экстракции хлороформом с точностью, удовлетворяющей задачи химико-токсикологической экспертизы.

При проведении деструкции по 2-му варианту без хлорной кислоты, были получены аналогичные результаты.

Прямое экстракционное определение ртути в печени в виде дитизоната дало возможность:

• а) сократить время отдельного определение ртути в 4—8 раз по сравнению с ранее предложенным осаждением на йодид меди;
• б) использовать для определения ртути более объективный инструментальный метод;
• в) сократить время деструкции в 2 раза (до 20—30 мин).

Поверочная реакция обнаружения ртути

Реакция образования однозамещенного дитизоната ртути в условиях исследования биологического материала специфична. Но при количествах ртути менее 0,005 мг окраска однозамещенного дитизоната ее в хлороформе и четыреххлористом углероде имеет желтовато-оранжевый цвет и может вызвать сомнение, так как продукты окисления дитизона при несоблюдении условий работы могут дать подобную окраску экстракта.

При сомнительной окраске экстракта дитизоната ртути мы предложили производить поверочную реакцию на ртуть с этим экстрактом. Дитизонат ртути реэкстрагировали в водную фазу и проделывали в ней реакцию на ртуть.

Экспериментальная проверка показала, что наилучшими реагентами для разложения дитизоната ртути являются: 0,25% раствор йода в 0,3% растворе йодида калия и 1,5% раствор тиосульфата натрия в 1 н. растворе соляной кислоты.

Для обнаружения ртути в полученных реэкстрактах была применена реакция образования тетрайодомеркуроата меди, так как проведению ее не мешает присутствие йодидов в указанной концентрации.

Методика исследования экстракта дитизоната ртути: экстракт встряхивали в делительной воронке в течение 60 с с 5 мл 0,25% раствора йода в 0,3% растворе йодида калия или с 5 мл 1,5% раствора тиосульфата натрия в 1 н. соляной кислоте. Реэкстракты отделяли от органической фазы, помещали в пробирку (при использовании тиосульфата натрия предварительно нейтрализовали кислоту), добавляли насыщенный раствор йода в 0,5% растворе йодида калия до уравнивания окраски с 0,25% раствором йода и 3 мл составного раствора (10% раствор сульфата меди, 2,5 н. раствор сульфита натрия и 8% раствор бикарбоната натрия в отношении 1:2:1,5) — в присутствии ртути появляется розовая окраска тетрайодомеркуроата меди.

Методика проверена на экстрактах дитизоната ртути, полученных при анализе 20 г печени. Результаты представлены в табл. 3.

Дополнительное использование в качестве поверочной реакции розовой окраски тетрайодомеркуроата меди позволяет сделать более надежным доказательство малых количеств ртути в органах человека. Затрата времени на проведение поверочной реакции в экстракте дитизоната ртути незначительна — до 5 мин.

Вывод

Разработан ускоренный метод определения ртути в органах человека в виде дитизоната. Граница определения 1•10^-3 мг в 20—50 г органа. Ошибка не превышает 8,2% при определении 0,01—2 мг в 20 г печени. Затрата времени — 60 мин.

Таблица 3

Результаты поверочной реакции тетрайодомеркуроата меди при анализе экстрактов дитизоната ртути

Количество ртути (2+) (в мг в 20 г печени)	Цвет экстракта дитизоната ртути	Результат реакции тетрайодомеркуроата меди при реэкстракции
		0,25% раствором йода	1,5% раствором тиосульфата натрия
Контроль	Желтый	+	+
»	»	—	—
»	»	—	—
0,001	»	++	++
0,001	»	+	+
0,005	Желто-оранжевый	++	++
0,005	Желто-»	++	+
0,01	Желто-»	+++	+++
0,01	Желто-»	++++	++++

Обозначения: — отрицательный результат, от + до ++++ — положительный результат (розовая окраска различной интенсивности).

 

¹ Очистка дитизона и других реактивов описана в книге Г. Иванчева «Дитизон и его применение». М., 1961, с. 73—96.