Опыт применения компьютерной плоидометрии в судебно-медицинской практике

С 1973 года с появлением монографии Г.Г. Автандилова «Морфометрия в патологии» начались широкие исследования пролиферативной активности патоморфологического материала с помощью морфометрических методик. Наибольшее развитие получило микроспектрофотометрическое исследование гистологических и цитологических препаратов (Г.Г. Автандилов,1984). Была установлена закономерность озлокачествления ткани, которая характеризовалась увеличением плоидности ядер и ускорением пролиферативных процессов. В судебно-медицинской практике подобных работ до настоящего времени не проводилось, хотя этот метод дает возможность судить о процессе пролиферации в органах (печень, почки, молочная железа, предстательная железа, эндометрий, шейка матки, кожа), как прижизненного реактивного явления в ответ на действие патогенного фактора на организм. В частности, имеются данные о том, что пролиферативная активность усиливается или замедляется в зависимости от силы и продолжительности действия физических и химических факторов. Согласно нашим исследованиям указанный метод был применен для уточнения темпа переохлаждения в случаях летальных исходов от гипотермии. Установлено, что при смерти в короткие сроки в слизистой оболочке желудка уровень пролиферативной активности клеток соответствует уровню физиологической регенерации ткани, а при медленном темпе переохлаждения отмечается усиление пролиферативных процессов в 2 раза.

Методика проведения плоидометрии.

С целью повышения качества и надежности патогистологических заключений был использован анализатор изображения «Имаджер-ЦГ» с версией программы для плоидометрии «Автан-Сан» (Г.Г.Автандилов, В.Е.Баскаков, К.Б.Саниев, 2001). Телевизионный анализатор изображения включает в себя микроскоп «Axio Star» фирмы «Carl Zeiss» с план-объективом 40х/0,65, светофильтр 570 нм, стандартную телевизионную камеру с разрешением 600х400 пикселей и компьютер Pentium (64 Мб). Для проведения плоидометрии в мазках и гистологических срезах необходимо следить за стандартизацией процесса фиксации материала, заливки в парафин, сохранения толщины гистологических срезов, окраски срезов (мазков) по Фельгену (для выявления в ядрах клеток ДНК). Рекомендуется использовать срезы толщиной 8 мкм или стандартно приготовленные мазки-отпечатки.

Настройку микроскопа начинают с установки освещения исследуемого препарата по Келлеру: закрыть до упора полевую диафрагму, перемещая конденсор вверх-вниз, добиться четкого изображения края диафрагмы, установить отверстие диафрагмы в центр поля зрения и открывать полевую диафрагму до тех пор, пока не будет видно равномерно все поле зрения микроскопа, установить светофильтр (560 нм).

Проводят обычное патогистологическое исследование и описывают препарат, затем находят наиболее типичный для изучаемого патологического процесса участок и переводят тубусную призму микроскопа в положение для направления изображения на видеокамеру анализатора изображения. Этот участок должен быть зафиксирован в памяти компьютера под определенным номером.

Компьютерный анализ изображения

Исследование окрашенных по Фельгену ядер проводят по соответствующей инструкции и получают данные о средних (простых и взвешенных) размерах объекта, т.е. площади оптического сечения ядер, их интегральной яркости (суммы яркости всех пикселей, приходящих на ядро) и плоидности исследуемых ядер клеток. Эти данные автоматически получают на экране дисплея с уточнениями максимальных и минимальных значений полученных базовых признаков, величинами их среднеквадратических отклонений и ошибок выборок. Кроме табличных данных на экран выводятся и гистограммы распределения полученных показателей.

При проведении плоидометрии на гистологических препаратах, прежде всего, следует получить «тканевый стандарт плоидности». Для этого необходимо измерить интегральную яркость ядер достаточной выборки малых лимфоцитов в том же гистологическом срезе (или в нормальном лимфатическом узле, вмонтированном в один парафиновый блок). За диплоидный набор хромосом (2с) принимают средние значения интегральной яркости ядер малых лимфоцитов. Значение «тканевого стандарта плоидности» равно половине среднего значения интегральной яркости ядер малых лимфоцитов (1с).

Затем анализируют все изображение и в автоматическом режиме производят деление значений интегральной яркости исследуемых ядер клеток на «тканевый стандарт плоидности». Редактируют результаты анализа, убирая различные артефакты (наложения ядер и т.д.), и получают гистограмму распределения ядер клеток исследуемой ткани в единицах плоидности, выраженных в псевдоцветах. При обозначении плоидности ядер клеток в гистологических срезах используют термины с приставкой «пара-», так как в срез попадают не только целые ядра, но и их фрагменты («парадиплоидные», «паратриплоидные и т.д.). Если плоидность ядра исследуемой клетки соответствует значению, лежащей в интервале 1,5с – 2,4с , то ядра считаются парадиплоидными, в интервале 2,5с – 3,4с – паратриплоидными, в интервале 3,5с – 4,4с – паратетраплоидными  и т.д.

В нормальных тканях и при ее гиперплазии, в доброкачественных опухолях, сохраняется преобладание диплоидных ядер клеток, образующих модальный класс на гистограммах. В пограничных и злокачественных опухолях отмечается преобладание клеток с тетра-, пента-, октаплоидными ядрами, возникшие в результате хромосомных аббераций и мутаций.

При использовании методов диагностической плоидометрии для проведения дифференциальной диагностики рекомендуется использовать следующий комплекс показателей:

• -  пределы колебаний полученных параметров измерений (lim);
• -  средние арифметические показатели, простые (М);
• -  средние арифметические, взвешенные («индекс накопления ДНК») - (М_взв);
• -  среднее квадратическое отклонение (s);
• -  ошибка выборки (m);
• -  характер гистограмм распределения ядер клеток по плоидности и по площади ядер, с оценкой выраженности ее парадиплоидной (1,5с-3,4с), паратетраплоидной (3,5с-4,4с) и анеуплоидной (более 4,5с) областей;
• - пролиферативную активность (ПА) исследуемого клона клеток ткани, соответствующего синтетической фазе цикла, которую устанавливают по превышению среднего диплоидного уровня содержания ДНК в интерфазных ядрах клеток (П) показателями, полученными для ядер исследуемой ткани (П - 2с).
• -  «показатель гетероплоидии ядер» (ПГЯ) – интенсивность различия между средними взвешенными и средними простыми показателями плоидности;
• -  «коэффициент анеуплоидии – КА» - частное от деления общего числа анеуплоидных ядер (выше 4,5с) на сумму диплоидных, триплоидных и тетраплоидных ядер (меньше 4,5с).

Различия между сравниваемыми группами считают достоверными при 0,95 уровне вероятности безошибочного суждения.

Наряду с использованием современных дорогостоящих методов морфологической диагностики, применение плоидометрического метода оказалось наиболее доступным, эффективным и достоверным в практике патологоанатома и судебно-медицинского эксперта.

Получаемые с помощью плоидометрического метода результаты исследований гистологических препаратов дают судебно-медицинскому эксперту дополнительную информацию о степени выраженности реактивных процессов в органах и тканях, а также расширяет круг экспертных доказательств при диагностике различных патологических состояний, особенностях пато- и танатогенеза.