Способы диагностики наркотической интоксикации

Диагностику наркотической интоксикации в настоящее время можно разделить на 3 позиции: морфологическая (стандартное секционное и гистологическое исследование (морфометрические методы), химическая (результаты судебно-химического исследования) и биохимическая диагностика (таблица №1).

Таблица №1. Способы диагностики наркотической интоксикации.

• ТСХ – тонкослойная хроматография
• ГХ-МС – газовая хромато-масс-спектрометрия
• ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
• ИХА – иммунохимический анализ

Некоторые сведения можно получить из анализа данных катамнеза (если таковой имеет место быть). Так, известны клинические признаки хронической наркотической интоксикации и острого отравления наркотическими веществами в виде различных видов токсико-гипоксической комы, которые могут быть отражены в материалах дела. Имеет значение социальный статус наркоманов.

Судебно-медицинское исследование трупа начинается, как правило, со стандартного секционного исследования, поэтому неудивительно, что многие авторы уделяют должное внимание морфологическим критериям острого отравления наркотическими веществами - танатолог со стажем визуально по общему виду трупа и по состоянию внутренних органов может высказать предварительный диагноз, и, как правило, диагноз подтверждается данными лабораторных исследований. Наружный осмотр тела может в некоторых случаях правильно сориентировать танатолога.

Химические критерии, если их можно так назвать, представляют собой результаты, полученные при проведении судебно-химических исследований.

Наркотические вещества с помощью химических методов определяют в крови (в цельной, возможно гемолизированной), моче, слюне, поте, гомогенатах тканей, волосах, ногтях, стекловидном теле глаза, цереброспинальной жидкости, желчи, у детей при невозможности взятия крови или мочи возможно исследования стула и мекония (Еремин С.К. с соавт, 1993, Лисовская С.Б., 2000, Asselin W.M. at al, 1992, Logan B.K., Luthi R., 1994, Moriya F. at al, 1995, Lillsunde P. at al, 1996, Samyn N., van Haeren C., 2000, Niedbala R.S. at al, 2001, Romolo F.S. at al, 2003, Jurado C., Sachs H., 2003).

На сегодняшний день стандартными методами при проведении судебно-медицинской экспертизы трупного материала на наличие наркотических веществ являются ГХ-МС, ВЭЖХ, тонкослойная хроматография (ТСХ) (Еремин С.К. с соавт., 1993). ГХ-МС и ВЭЖХ являются высокоточными, чувствительными методами, используемыми в качестве подтверждающих исследований, однако, трудоемки и весьма дорогостоящи. Приоритет отдают методу тонкослойной хроматографии, экономически выгодному, хотя и менее чувствительному, нежели остальные методы (Саломатин Е.М., Николаева Э.Г., 1999, Горбачева Н. А., Орлова А. М., 2003).

Судебно-химическое исследование является трудоемким процессом, производящимся в срок до 1 месяца. Поэтому не приходится удивляться тому, что эксперты-танатологи берут инициативу в свои руки и занимаются определением наличия наркотических веществ в моче прямо у секционного стола, используя при этом различные иммуноферментные тест-полоски, чувствительность и специфичность которых весьма удовлетворительна (Кригер О.В., Могутов С.В., Бутовский с соавт., 2001, Шигеев В.Б., Шигеев С.В., 2001). Однако, использование только тест-полосок при вынесении заключения о наличии наркотических веществ недопустимо, так как, в отличие от токсикологического (наркологического) анализа, судебно-химического исследование для надежной идентификации наркотических средств не может основываться на результатах менее, чем 2-х аналитических методов.

В связи с выше изложенным необходимо отметить огромное значение данных лабораторных исследований на наличие наркотиков. Поиск оптимального определения наркотиков в биологических жидкостях трупа продолжается.

Горбачева Н. А., Орлова А. М. (2003) приводят результаты изучения идентификации опийных алкалоидов (морфин, кодеин, их синтетический аналог героин) в моче при судебно-химическом исследовании с использованием метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Отмечено, метод ТСХ уступает методу ГХ-МС (с дериватизацией) по чувствительности обнаружения опиатов, а также по специфичности их идентификации. Однако, метод ТСХ-анализа может оказать существенную помощь при судебно-химическом исследовании мочи на опиаты и в определенных интервалах концентраций может быть применен в комбинации с другими методами анализа, такими как ГХ-МС и ВЭЖХ.

Существует мнение о необходимости создания системы экспресс-диагностики наркотических веществ в биожидкостях, что довольно проблематично. Сучкова С.Н., Томилин В.А. (1995) приводят ряд факторов, обусловливающих данную проблему: низкая концентрация наркотиков в биологических жидкостях, наличие конъюгированных форм, недостаточная специфичность и чувствительность колориметрических реакций, идентифицирующих наркотические вещества.

В последние годы эту проблему многие исследователи, как в России, так и на Западе, пытались решить с использованием методов иммунохимического анализа, таких как поляризационный флуороиммуноанализ и гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) (Москвичева И.В. с соавт., 1991, Лисовская С.Б. с соавт, 2000, Fraser AD., 1990, Badia R. et al., 1998, Kerrigan S. at al, 2001, Kottenhahn B., 2002).

Иммунохимические методы анализа достаточно широко распространены. Существует несколько видов иммунохимических методов анализа (Еремин С.К. с соавт.,1993):

Таблица №2. Иммунохимические методы анализа (по Еремину С.К., Изотову Б.Н., Веселовской Н.В., 1993)

В судебной токсикологии наиболее распространены следующие иммунохимические методы: ИФА, РИА и ПФИА (Еремин С.К. с соавт.,1993).

Метод ИФА был предложен в начале 70-х гг тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США (Фримель Г., 1987). Иммуноферментный анализ основан на принципе связывания антител с меченным антигеном, адсорбированным на твердой “подложке” (Ройт А., 1991, Самуилов В.Д., 1999, Лисовская С.Б., 2000). Этот метод высокочувствителен, практически не требует пробоподготовки, прост в употреблении (Еремин С.К. с соавт, 1993, Воронин Е.С. с соавт., 2002). Чувствительность ИФА позволяют определять пикограммовые количества веществ (Лисовская С.Б., 2000). Различают гомогенный и гетерогенный варианты ИФА. В основе гомогенного варианта, применяемого для определения низкомолекулярных субстанций (гаптены), лежит ингибирование активности фермента при соединении его с гаптеном, либо потеря активности маркерного фермента в результате реакции Антиген-Антитело. При гетерогенном ИФА антиген или антитело фиксируется на твердой фазе, непрореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмыванием (Фримель Г., 1987, Самуилов В.Д., 1999). В настоящее время иммуноферментный анализ прочно занял достойное место среди прочих клинико-диагностических и лабораторных исследований, в том числе в судебно-медицинской экспертизе.

Современный ИФА наркотических средств не требует специальной подготовки пробы, чувствителен, специфичен, удобен для скрининг-диагностики (Еремин С.К. с соавт., 1993, Лисовская С.Б. с соавт., 2000). Наборы для определения наркотических веществ группы опиатов в крови и моче называются диагностикумами. Они позволили сократить время проведения имммуноферментного анализа и избавиться от подготовки планшета и двухстадийности процесса. Некоторые авторы при проведении иммунохимического анализа используют методы очистки образцов тканей - экстракция водой (Лисовская С.Б., 2000), метод пробоподготовки образцов мочи - преципитация ацетона (Lillsunde P, at al, 1996, Kaferstein H, Sticht G., 1998., Bogusz M., at al, 1990), пробоподготовка гемолизированной крови путем добавления сульфосалициловой кислоты (получение чистого супернатанта), нейтрализация супернатанта ацетатом аммония (Moriya F, Hashimoto Y., 1996), использование трихлоруксусной кислоты (McCord CE, McCutcheon JR., 1988). Описано применение иммунологических экспресс-тестов для диагностики наркотических веществ в моче, что позволяет получить результат быстро и без соответствующей подготовки материала (Еремин С.К. с соавт., 1993, Сучкова С.Н., Томилин В.А., 1995, Кригер О.В. с соавт., 2001, Шигеев В.Б., Шигеев С.В., 2001). Павленко Е.Ю. с соавторами (2003) впервые применили тест-полоски с целью выявления наркотических веществ группы опиатов для исследования жидкости из полости перикарда, что дало положительный результат. Однако, некоторые авторы считают экспресс-тесты недостаточно чувствительными, имеющими характер предположительного доказательства, которые не могут быть интерпретированы в виде окончательного заключения (Еремин С.К., 1993, Kaplan R.M. at al, 1989).

Niedbala RS, Kardos K, Waga J at al (2001) исследовали образцы слюны и мочи методом иммуноферментного анализа и ГХ-МС с целью обнаружения опиатов. Согласно полученным данным, слюна является информативным источником для выявления наркотиков группы опиатов и может при необходимости служить заменой моче.

Samyn N, van Haeren C. (2000) использовали неинструментальный ИФА (тест-системы) для обнаружения наркотических веществ (кокаина, опиатов, амфетаминов и каннабиноидов) в слюне и поте. В случае положительного результата хотя бы в одном образце, производили исследование крови и слюны методом ГХ-МС. В пяти из шести случаев употребления кокаина, концентрация кокаина в слюне превысила 1000 нг/мл. В группе амфетаминов в 13 случаях концентрации наркотика в слюне превысили порог 1000 нг/мл Результаты обнаружения кокаина и амфетаминов в слюне, поте и моче методом тест-систем и ГХ-МС были идентичны.

 При отсутствии мочи предлагается определять концентрацию морфина и кодеина в крови и их количественное соотношение. Отношение концентраций морфин/кодеин больше единицы свидетельствует об употреблении героина. Если показатель ниже единицы, то можно говорить об употреблении кодеина (Ceder G, Jones AW., 2001).

Описано определение опиатов в стекловидном теле глаза методом поляризационного флуороиммуноанализа, что дало основание считать стекловидное тело альтернативой крови и моче и использовать такой объект при выявлении наркотических веществ группы опиатов. Также по соотношению морфин/кодеин в стекловидном теле глаза можно делать выводы об употреблении героина аналогично такой диагностике в крови (Lin D.L., at al, 1997).

По данным литературы возможно определение наркотических веществ в меконии детей при отсутствии возможности исследовать кровь и мочу, в частности описано выявление опиатов и кокаина иммунохимическими методами в меконии (Moriya F. at al, 1995). Есть данные по исследованию иммунохимическими методами цереброспинальной жидкости с целью выявления опиатов. По данным авторов, в зависимости от концентрации морфина в цереброспинальной жидкости может изменяться работа дыхательного центра (Moriya F. at al, 1996).

Lee CW, Lee HM. (1989) исследовали с помощью Abbott TDx анализатора, предназначенного для анализа мочи и сыворотки, образцы цельной крови с целью обнаружения опиатов. Помимо цельной крови авторы исследовали на данном анализаторе печень, желчь и мочу для выявления опиатов. Пробоподготовка образцов не производилась. Исходя из данных, в желчи не были обнаружены опиаты методом ИФА, соответственно, этот материал должен быть исследован другими методами. Gronholm M, Lillsunde P. (2001) сравнили результаты исследования образцов мочи и слюны на амфетамины, опиаты, каннабиноиды и метаболиты кокаина с помощью различных иммунохимических методов. Положительные и отрицательные образцы были сопоставлены с ГХ-МС. Для мочи совпадение результатов составило 93-99% для амфетаминов, 97-99% для каннабиноидов, 94-98% для опиатов и 90-98% для бензодиазепинов. Однако в слюне выявить бензодиазепины и каннабиноиды не удалось.

Baskin LB, Morgan DL. (1997) исследовали биологический материал методом ВЭЖХ и ГХ-МС. Интересным является установленный авторами факт отсутствия влияния возраста, пола человека, его этнической принадлежности, времени дня, дня недели взятия материала у потенциального наркомана на наличие и концентрацию наркотических веществ.

Лисовская С. Б., Смиpнов А. В., Симонов Е. А. и соавторы (2000) рассмотрели условия изолиpования опиатов из тканей и анализ полученных экстpактов иммунохимическими методами. Авторы в основном использовали поляpизационный флюоpесцентный иммуноанализ - метод, применяемый достаточно давно. ПФИА нашел широкое применение в клинической и судебной токсикологии. Keller T, Schneider A, Dirnhofer R. (2000) сообщают о возможности использования ПФИА для быстрого обнаружения в образцах крови опиатов, бензодиазепинов, барбитуратов, метадона после соответствующей пробоподготовки.

Лисовской С.Б. (2000) была разработана система методик качественного и количественного поляризационного флуороиммуноанализа для экспресс-диагностики опиатов, бензодиазепинов и барбитуратов в биоматериале. Исследуемым материалом являлись биологические жидкости организма, такие как кровь и моча, ткани печени и почек, а также волосы и ногти, предоставленные Бюро СМЭ ДЗМ. Метод можно применять для исследования нетрадиционных объектов в судебно-медицинской экспертизе на наркотики - волос и ногтей. Что немаловажно, иммунохимические методы эффективны в экономическом плане и позволяют получить результат гораздо быстрее, чем стандартные химические методы.

Нельзя однозначно оценивать значение результатов лабораторного анализа наркотических веществ в крови и моче для дифференциальной диагностики острой наркотической интоксикации и абстинентного синдрома. Наиболее информативны в этом случае результаты сочетанного исследования крови и мочи, а именно: при обнаружении наркотиков в крови, особенно при выявлении опиатов в моче в высокой концентрации (10-100 мкг/мл) всегда подтверждается диагноз острой интоксикации; отсутствие опиатов в крови и моче больных наркоманией соответствует абстинентному состоянию (Сучкова С.Н., Томилин В.А., 1995).

Хроническая наркотическая интоксикация может быть диагностирована посредством выявления наркотических и других одурманивающих средств в биосредах, депонирующих эти вещества в течение длительного времени (волосы, ногти) (Jurado C, Sachs H., 2003). Показано, что после одноразового употребления наркотики обнаруживаются в волосах не ранее, чем через 5-7 дней (когда они уже не выявляются в крови, слюне и моче), и сохраняются в волосах, не метаболизируясь, в течение нескольких лет (Cone E.J., 1990, Goldberger B.A. at al, 1991). Учитывая постоянную скорость роста волос на различных участках лица и головы (1-1.3 см в мес), посредством анализа наркотических веществ в различных волосяных сегментах можно сориентироваться в сроках давности злоупотребления наркотиками. Поскольку концентрация наркотиков в волосах является дозозависимой, то по результатам анализа можно приблизительно судить об интенсивности потребления. Тем не менее, по результатам определения наркотиков в волосах нельзя определить степень тяжести наркотической зависимости. В волосах потребителей депонируются такие виды наркотических и одурманивающих веществ, как опиаты, амфетамины, каннабиноиды, бензодиазепины, барбитураты, присутствие которых адекватно выявляется только с помощью высокочувствительных химико-токсикологических методов как РИА, ГХ/МС, ВЭЖХ вследствие их низкой концентрации (нг/мл) (Romolo FS at al, 2003). В связи с этим на исследование требуется не менее 10 мг волос (оптимально – 50 мг). С помощью исследования волос можно дифференцировать потребителей героина и потребителей морфина, так как метаболит морфина 6-моноацетилморфин сохраняется в волосах более года, в то время как в моче он определяется в течение 5 часов после приема (Tagliaro F. at al, 1985). Независимо от способа проведения анализа волос на наркотические вещества (РИА, ГХ/МС, ВЭЖХ), такое исследование требует длительной предварительной подготовки образца - промывание волос в смеси органических растворителей, кислотный или щелочной гидролиз образца (12-18 ч), экстрагирование анализируемых веществ из гидролизата посредством жидкостной или твердофазной экстракции (Лисовская С.Б., 2000, Romolo FS at al, 2003).

Результаты, полученные иммунохимическими методами при исследовании биологического материала, в том числе гемолизированной трупной крови, как правило, сопоставляют с результатами, полученными методом газовой хромато-масс спектрометрии (ГХ-МС) (Moritz F. at al, 1999, Toennes S.W. at al, 2001, Wilson J.F. at al, 2001, Peters F.T. at al, 2003) и другими аналитическими методами.

Таким образом, можно сделать заключение о необходимости комплексных лабораторных исследований, т.е. сочетании различных методов, что позволит повысить качество исследований и, в конечном итоге, облегчит интерпретацию результатов экспертами-танатологами.