К вопросу о регламентировании в Российской Федерации разработки и производства компонентов для молекулярно-генетических технологий

Основными производителями реагентов для судебно-экспертного молекулярно-генетического анализа являются зарубежные фирмы. Поэтому отечественные потребители данной продукции неизбежно сталкиваются с определенными проблемами, такими, например, как относительно высокая стоимость реагентов, долгие сроки поставок, сложности с таможенным контролем и рекламациями.

На фоне ограниченного финансирования молекулярно-генетических лабораторий и, в целом, учреждений судебно-медицинской экспертизы, эти осложнения естественным образом провоцируют в нашей стране неблагоприятное развитие ситуации.

Это не только случаи неправильного использования фирменных наборов реагентов, когда, например, в связи с отсутствием необходимого оборудования недопустимо упрощаются и нарушаются технологические процедуры и схемы анализа.

Не меньшую опасность представляет стихийное производство самодельных (так называемых, in-house) реагентов, отдельных компонентов, а иногда и комплектных импортозамещающих наборов реагентов для обеспечения производства экспертных исследований, которые делаются отдельными продвинутыми пользователями в кустарных условиях без надлежащего контроля качества и в отсутствие каких–либо утвержденных стандартов.

Эта «теневая» активность во многом обусловлена тем, что стоимость импортных комплектных наборов во много раз превышает стоимость входящих в них отдельных реагентов. Однако, использование in-house продуктов чревато неблагоприятными последствиями. Анализу некоторых из них посвящена наша работа [1]. Также, это может быть недостаточная чувствительность используемых тест-систем, невозможность внешней оценки качества проводимых экспертиз, невозможность включения результатов экспертиз в единую межлабораторную базу данных. Кроме проблем с недостаточной чувствительностью и угрозой контаминации могут возникнуть проблемы с воспроизводимостью результатов и их интерпретацией. Следствием этого будет получение неправильного результата экспертизы.

Положение усугубляется тем, что хотя in-house компоненты изначально предназначаются для внутреннего потребления в конкретной лаборатории, они, в качестве импортозамещающих продуктов, проникают и на коммерческий рынок.

Решение проблемы нежелательных in-house продуктов для судебно-экспертных молекулярно-генетических технологий видится в разработке и принятии дополнительных мер по стандартизации в Российской Федерации судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных технологий. Необходимо дальнейшее усовершенствование и развитие законодательно-правовой базы в области проведения молекулярно-генетических экспертиз в части регламентирования разработки, производства и внедрения отечественных компонентов для молекулярно-генетических технологий, не уступающих или превосходящих по качеству аналогичные наборы зарубежного производства, но имеющих при этом значительно более низкую стоимость и преимущества, предоставляемые производством внутри страны (быстроту доставки, независимость от политики иностранных государств и фирм в области внешней торговли и т.д.).

Примером такого подхода может служить наблюдающееся в последние годы в Российской Федерации эффективное развитие технологий ДНК-диагностики инфекционных заболеваний. Российскими научно-производственными фирмами созданы диагностические наборы реагентов для ПЦР-диагностики широкого спектра инфекционных заболеваний. Благодаря хорошему соотношению цена/качество отечественные наборы реагентов практически полностью вытеснили зарубежные аналоги с российского рынка. Отметим, что в области ДНК-диагностики инфекционных заболеваний в значительной мере решены основные правовые и законодательные вопросы. Так например, регламентированы правила производства и использования диагностических наборов [2-4]; усилиями контролирующих организаций в сфере здравоохранения РФ осуществляется контроль качества производства диагностических наборов и проведения соответствующих анализов в клинико-диагностических лабораториях.

Следует признать, что по сравнению с ПЦР-диагностикой инфекций, судебно-медицинские идентификационные исследования с применением молекулярно-генетических методов анализа представляют технологии более высокого уровня сложности. Поэтому здесь развитие импортозамещающей отечественной реагентной базы требует больших усилий и, соответственно, большего времени. Тем важнее обратиться к этой проблеме безотлагательно.

Нами проводятся исследования в этом направлении. Настоящая работа посвящена концептуальной проработке отдельных вопросов, касающихся стандартизации материалов и технологий для судебно-медицинского молекулярно-генетического анализа.

Методика анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК при выполнении молекулярно-генетической экспертизы [5] включает несколько последовательных стадий.

Качество выполнения каждой стадии работы определяет конечный результат анализа. Однако, в отсутствие единых технологических стандартов, эффективно проводить внешнюю оценку качества выполняемых экспертиз не всегда позволяет сама специфика экспериментальных стадий, которая напрямую зависит от тех или иных используемых различных материалов и технологий.

Одним из возможных решений в этом плане может быть оговоренное условие проведения анализа по единой технологической схеме, на рекомендованном оборудовании и в рекомендованных условиях, с использованием на всех стадиях апробированных реагентов.

Казалось бы, в русле этих пожеланий, уже сейчас можно попытаться соблюсти принцип единства технологической схемы, приобретая все компоненты для производства экспертных исследований у отечественного производителя. Как уже говорилось, в условиях российской действительности, предпринимаются попытки непосредственно в исследовательских или сервисных лабораториях самостоятельно готовить отдельные компоненты или комплектные наборы реагентов для обеспечения производства экспертных исследований. При этом производятся не только наборы для амплификации ДНК, но также наборы реагентов для выделения ДНК из биологического материала и наборы реагентов для последующей детекции продуктов ПЦР – например, реагенты для окрашивания гелей серебром.

Однако, это не есть полноценное производство. Это - самодеятельность, которая может иметь неблагоприятные последствия как в профессиональном плане, так и в юридической сфере.

Напомним, что согласно приказу Минздрава России от 10 мая 2000 г. № 156 [3], применение на территории Российской Федерации наборов реагентов разрешается только после проведения в установленном порядке их государственной регистрации - при условии того, что производимые наборы соответствуют ГОСТ 51088-97 [2]. Таким образом, качество наборов реагентов для молекулярно-генетической экспертизы должно обеспечиваться как самим производителем, так и соответствующими контрольными институтами системы здравоохранения.

Разработка и производство наборов реагентов для анализа ПДАФ ДНК – сложный технологический процесс, при котором следует учитывать целый ряд условий, невыполнение которых может привести к получению инструмента, не способного обеспечить получение правильного результата. Поэтому разработка и производство наборов реагентов, соответствующих необходимым требованиям, могут быть осуществлены только в специализированных лабораториях, имеющих необходимый опыт работы и подходящую производственную базу.

Накопленный нами практический опыт в области производства отечественных компонентов для молекулярно-генетических технологий, и соответствующая проведенная аналитическая работа, позволяют перейти к конкретным предложениям. В нашем понимании, наборы реагентов для проведения молекулярно-генетических экспертных исследований с использованием технологии анализа ПДАФ ДНК, должны удовлетворять следующим требованиям:

• - включать в свой состав все реагенты, необходимые для проведения анализа по единой технологической схеме, начиная от реагентов для выделения ДНК и заканчивая реагентами для выявления фрагментов ДНК в геле;
• - обеспечивать высокую чувствительность и специфичность;
• - быть удобными в использовании.

Особое значение имеет взаимная «подгонка» всех компонентов набора. Все компоненты должны быть соответствующим образом протестированы как по отдельности, так и в составе набора, с тем, чтобы обеспечивать необходимый уровень чувствительности и специфичности в течение всего срока годности набора реагентов.

Важным условием удобства использования является хорошо продуманный формат наборов реагентов. В частности, если говорить об энзиматической амплификации ДНК, то преимущество имеют наборы, выполненные в двухкомпонентном формате, включающие: (1) смесь для ПЦР (праймеры, буферный раствор, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты) и (2) термостабильную ДНК-полимеразу.

Одной из интересных современных тенденций в этом направлении является изготовление сухих однокомпонентных наборов реагентов для амплификации ДНК. Следует, однако, учитывать, что, несмотря на ряд преимуществ таких наборов (простота формата, возможность хранения при комнатной температуре, удобство транспортировки), применение таких наборов в широких масштабах чревато контаминацией лабораторных помещений из-за повышенной «летучести» лиофилизированных компонентов набора, в частности, аллельных лестниц.

Для повышения удобства работы с наборами могут быть использованы особые технические приемы, например, разработка аллельных маркеров со специфическим набором фрагментов. Для таких аллельных лестниц характерно отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК, соответствующих определенным аллелям. Наличие такого «гэпа» облегчает интерпретацию результатов и позволяет избежать возможных ошибок при идентификации аллелей в исследуемых образцах.

Необходимо, чтобы используемый аллельный маркер был гомологичен анализируемой ДНК, т.е. чтобы маркерные фрагменты ДНК аллельной лестницы точно соответствовали аллелям анализируемого локуса не только по длине, но и по нуклеотидной последовательности. Только при этом условии можно добиться однозначного соответствия подвижности фрагментов, получаемых при амплификации анализируемой матричной ДНК и фрагментов аллельной лестницы.

При анализе следовых количеств биологического материала, что является стандартной практикой при производстве судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз, особенно важна высокая чувствительность. Существуют подходы, позволяющие повысить чувствительность и специфичность полимеразной реакции за счет использования для амплификации ДНК термостабильных ДНК-полимераз с улучшенными свойствами, например, модифицированных ферментов со встроенным «горячим стартом» для ПЦР - аналогов AmpliTaq Gold (PE Applied Biosystems, США). Применение таких ферментов и тщательный подбор условий реакции позволяют также избежать появления дополнительных артефактных полос на геле при амплификации «проблемных» локусов, то есть в какой-то мере решить проблему ложного генотипирования.

Этой же цели получения надежных и достоверных результатов служит проведение электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, поскольку при этом нивелируется влияние на электрофоретическую подвижность в геле анализируемых полинуклеотидов различий в их вторичной структуре, возможных мутаций и полиморфизма [6, 7]. Поэтому предпочтительно комплектовать наборы реагентами, которые обеспечивают выявление фрагментов ДНК после проведения электрофореза путем прокраски геля серебром. Этот способ визуализации фрагментов ДНК существенно повышает чувствительность анализа по сравнению с прокраской бромистым этидием.

Отдельной проблемой, появляющейся при проведении достаточно большого количества экспертиз или исследований, является контаминация лабораторного помещения фрагментами ДНК, полученными при амплификации. Проблема решается с помощью специальных наборов реагентов для энзиматической амплификации ДНК, которые содержат компоненты, обеспечивающие антиконтаминационные свойства системы при проведении массовых анализов.

Типовой комплектный набор для амплификации ДНК, обеспечивающий защиту от контаминации, содержит модифицированную термостабильную ДНК-полимеразу со встроенным «горячим стартом», dUTP в качестве одного из компонентов смеси dNTP и фермент урацил-ДНК-гликозидазу, обеспечивающий выщепление урацила из ДНК. При использовании таких наборов, полученные в процессе амплификации фрагменты ДНК содержат в своем составе урацил. При случайном попадании в пробирку для амплификации ДНК они подвергаются ферментативному воздействию урацил-ДНК-гликозидазы, выщепляющей урацил из цепей ДНК (при последующем нагревании в месте выщепления урацила происходит разрыв цепи ДНК). Урацил-ДНК-гликозидаза работает в течение первых 10 минут при 37°С. При этой температуре модифицированная термостабильная ДНК-полимераза неактивна и полимеризации не происходит. Следующий за этим прогрев при 95°С в течение 10 мин инактивирует урацил-ДНК-гликозидазу и активирует ДНК-полимеразу. В последующих циклах амплификации нарабатываются урацил-содержащие фрагменты ДНК, не способные выступать матрицами для ПЦР в этой системе амплификации.

Существенно облегчить интерпретацию результатов и, в целом, повысить эффективность и надежность судебно-экспертного типирования ДНК, можно за счет уменьшения длины анализируемых фрагментов - так, чтобы она не превышала 250 п.н. Это достигается путем разработки новых праймерных пар для анализируемых локусов. Дело в том, что в случае относительно длинных полинуклеотидов - длиной более 250 п.н., - для хорошего разделения фрагментов ДНК и, соответственно, получения достоверных результатов генотипирования, необходимо значительно увеличивать время электрофореза. Это увеличивает общее время анализа и не всегда хорошо сказывается на качестве получаемой картины разделения фрагментов ДНК. Кроме того, уменьшение размера амплифицируемых фрагментов важно с точки зрения получения хороших результатов при анализе образцов, содержащих деградированную ДНК. Здесь оптимальным представляется диапазон размеров анализируемых фрагментов ДНК от 100 до 250 п.н. [8].

В дополнение отметим, что такой диапазон размеров позволяет одновременно анализировать аллельные варианты нескольких локусов в одном геле, что открывает возможность использования высокоэффективных мультиплексных форматов. Результаты этих исследований будут опубликованы отдельно.