Сравнительное исследование аллельного разнообразия 6 микросателлитных локусов для двух групп населения Уральского региона России

Введение

Короткие тандемные повторы, или микросателлиты, состоящие из 2-7 нуклеотидных повторов, широко представлены в геноме человека и характеризуются выраженным полиморфизмом длины. Это делает их высокоэффективными маркерами для молекулярно-генетической индивидуализации человека. Типирование микросателлитов геномной ДНК человека, основанное на полиморфизме длины амплифицированных фрагментов ДНК, в настоящее время является основным методом судебно-медицинского молекулярно-генетического исследования вещественных доказательств [ 3 ]. Широко используемое в настоящее время мультилокусное типирование микросателлитов объединяет специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции (ПЦР) с высоким дискриминирующим потенциалом.

Расчет частоты встречаемости генетического профиля в популяции для оценки силы молекулярно-генетического доказательства проводится с привлечением популяционных баз данных. Известно, что аллельные частоты могут отличаться для разных территориально-этнических групп, и потому общепринятой практикой является создание баз данных для основных расовых групп, которые включают наиболее крупные популяционные группы [ 8 ].

Проведенные нами ранее популяционные исследования европеоидов Уральского региона России позволили оценить аллельные частоты и некоторые статитстические параметры для микросателлитных локусов D13S317, D7S820, D16S539, F13B, FESFPS, THO1 и TPOX [ 5, 6, 9 ]. По данным Всероссийской переписи населения 2002 года, в национальном составе населения Челябинской области наибольшую представленность имеют русские – 82,3%, татары – 5,7%, башкиры – 4,6% и украинцы - 2,1% [ 2 ]. Учитывая наибольшее сходство генофонда башкир с татарами среди народов Волго-Уральского региона на основании кластерного анализа по данным полиморфизма 15 аутосомных локусов ДНК [ 4 ], мы сочли возможным объединить их в татаро-башкирскую популяционную выборку (ТБП). Русские и украинцы были объединены в славянскую популяционную выборку (СП).

Целью данного исследования было сравнить распределение аллельных частот и некоторые статистические параметры, представляющие судебно-медицинский интерес, для микросателлитных локусов D13S317, D7S820, D16S539, THO1, TPOX и CSF1PO в ТБП и СП.

Материалы и методы

Образцы крови были получены от неродственных индивидуумов, проживающих в Уральском регионе России (Челябинская, Свердловская области, Республика Башкортостан). Национальная принадлежность доноров крови устанавливалась либо путем опроса, либо по документам удостоверяющим личность (паспорт РФ старого образца, свидетельство о рождении ребенка). ДНК выделяли методом органической экстракции с использованием протеиназы К/фенол-хлороформа.

ДНК амплифицировали с помощью наборов GenePrint^® Fluorescent STR System (Promega Corp., США). Условия амплификации соответствовали рекомендациям производителя [ 7 ]. Амплификацию проводили в GeneAmp^TM PCR System 9600 Thermal Cycler (Perkin Elmer, США).

Разделение и идентификацию ПЦР продуктов проводили в мультилокусном режиме с помощью прибора для капиллярного электрофореза P/ACE 5510 (Beckman Coulter, США), оснащенного детектором лазер-индуцированной флюоресценции с одной длиной волны [ 5, 6, 9 ].

Частоту каждого аллеля расчитывали исходя из наблюдаемого числа генотипов в исследованных популяционных выборках. Возможное отклонение генотипических частот тестированных локусов от равновесия Харди-Вайнберга (РХВ) проверяли с помощью расчета несмещенной оценки ожидаемой гетерозиготности и ее стандартной ошибки, а также с помощью точного теста [ 1 ]. Популяционную гомогенность аллельных частот исследованных локусов между ТБП и СП Уральского региона проверяли с помощью программы chirxc.exe.

Результаты и обсуждение

Распределение наблюдаемых аллельных частот исследованных микросателлитов в ТБП и СП показано в Табл. 1. Проверку гипотезы независимости аллелей микросателлитных локусов в обеих популяционных пробах проводили с помощью точного теста, а также сравнения наблюдаемой и ожидаемой частоты гетерозигот исследованных локусов.

Точный тест показал (см. Табл.2), что распределения генотипов 6 тестированных локусов в ТБП и СП не отклоняются от РХВ в значительной степени. Кроме того, наблюдаемая и ожидаемая частота гетерозигот исследованных локусов также не отличались друг от друга в значительной степени. Таким образом, можно заключить, что обе популяционные выборки почти соответствует РХВ. Уровни наблюдаемой гетерозиготности типированных микросателлитов были сходными в обеих популяционных пробах. Статистические параметры, представляющие судебно-медицинский интерес, исследованных микросателлитов (Табл. 2) показали, что наиболее информативными в обеих популяционных пробах являются локусы D13S317, D7S820, D16S539 и THO1. Общий дискриминирующий потенциал для всех 6 тестированных микросателлитных локусов в ТБП и СП составил 0,9999993 и 0,9999990, соответственно. Усредненный индекс отцовства для всех 6 тестированных микросателлитных локусов в ТБП и СП составил 63,1 и 70,2, соответственно.

Тестирование нулевой гипотезы гомогенности аллельных частот 6 исследованных локусов между ТБП и СП было проведено с использованием программы chirxc.exe (см. Табл. 3). Отклонение от популяционной гомогенности выявлено для локусов D13S317, D16S539 и THO1. Аллельные частоты остальных 3 локусов сравниваемой пары популяционных проб были однородными.

Заключение

Проведенное нами исследование установило распределение наблюдаемых аллельных частот 6 микросателлитов в татаро-башкирской и славянской популяционных выборках Уральского региона России. Распределения генотипических частот всех тестированных локусов в обеих популяционных выборках не отклоняются от РХВ в значительной степени. Общий потенциал дискриминации для всех 6 тестированных микросателлитных локусов в ТБП и СП составила 0,9999993 и 0,9999990, соответственно. Усредненный индекс отцовства для всех 6 тестированных микросателлитных локусов в ТБП и СП составил 63,1 и 70,2, соответственно. Следовательно, исследованный набор локусов является высокоинформативным для обеих исследованных популяций.

Тестирование нулевой гипотезы гомогенности аллельных частот 6 исследованных локусов между ТБП и СП выявило отклонение от популяционной гомогенности для локусов D13S317, D16S539 и THO1. Аллельные частоты остальных 3 локусов для сравниваемых выборок были однородными.

Выявленные нами отличия в распределении аллельных частот локусов D13S317, D16S539 и THO1 в двух разных популяционных выборках в определенной степени иллюстрируют значимость учета этнического происхождения индивидуума при оценке силы молекулярно-генетического доказательства. Однако этот вопрос в плане практического применения требует дополнительных количественных оценок. Для этого нами проводятся исследования, результаты которых будут опубликованы отдельно.

Таблица 1

Аллельные частоты 6 микросателлитных локусов в татаро-башкирской (ТБП) и славянской (СП) популяционных пробах Уральского региона России

Примечание. 1 - аллели каждого локуса идентифицировали путем прямого сопоставления с соотвествующим аллельным лэддером, входящим в состав наборов GenePrint Fluorecent STR System (Promega Corp., США). 2 – в ходе данного исследования оценивали суммарную частоту встречаемости аллелей 9.3 и 10 для локуса THO1. n = количество неродственных индивидуумов.

Таблица 2

Точный тест на РХВ и статистические параметры 6 микросателлитных локусов в татаро-башкирской (ТБП) и славянской (СП) популяционных выборках Уральского региона России

Примечание. ET = точный тест, Ho = наблюдаемая гетерозиготность, He = ожидаемая гетерозиготность, SE = стандартная ошибка, Pd = потенциал дискриминации; MP = вероятность случайного совпадения, PE = потенциал исключения, TPI = усредненный индекс отцовства. Точный тест вычисляли с помощью программы GDA1. Расчет статистических параметров проводили с помощью программы PowerStats (Promega Corp.).

Таблица 3

Тестирование гомогенности аллельных частот 6 микросателлитных локусов между татаро-башкирской (ТБП) и славянской (СП) популяционными выборками Уральского региона России.

Примечание. ET = точный тест; * - P < 0,05.