Трудности дифференцирования групп М и N в пятнах крови

Метод абсорбции в количественной модификации для выявления антигенов М и N в пятнах крови не нашел практического применения ввиду неспецифического связывания антител сывороток и низкой абсорбционной способности антигенов М и особенно N. То же относится и к методу абсорбции-элюции в модификациях, которые использовали Pereira (1963), Munscher (1967), Kruger (1969) и др.

В настоящее время все еще нет достоверного метода установления групп М и N в пятнах крови, что можно объяснить близостью химической структуры антигенов М и N и особенностями гетероиммунных (кроличьих) сывороток.

Мы поставили перед собой задачу разработать оптимальный вариант реакции абсорбции-элюции, обеспечивающий выявление антигенов М и N при использовании сывороток с низким титром, изыскать способы устранения побочных явлений и изучить этот метод на экспертном материале.

Наше исследование объединяло два основных направления: а) подавление активности побочной субстанции в антигенах М и N физическим и химическим воздействием на пятна крови: обработка ацетоном, формалином, эфиром, метанолом, кипячение в дистиллированной воде и в физиологическом растворе хлорида натрия и т. д.; б) изучение свойств гетероиммунных (кроличьих) сывороток, изготовляемых Институтом судебной медицины для определения групп М и N в жидкой крови, с целью нахождения критериев пригодности их в реакции абсорбции-элюции (значение специфичности, высоты исходного титра, возможность разведения сывороток и др.).

Как показали наши исследования, предварительная обработка пятен снижает побочное связывание разноименных антител сыворотки в реакции абсорбции-элюции. По нашему мнению, для выявления антигена М наиболее эффективна обработка метанолом. При обнаружении антигена N в зависимости от свойств используемых сывороток анти-N необходима либо обработка метанолом, либо кипячение в физиологическом растворе хлорида натрия.

Для изучения особенностей сывороточных реагентов в указанной выше реакции исследовали сыворотки анти-М 31 серии и анти-N 36 серий. Вначале их проверяли в исходном титре и в разных разведениях в отношении специфичности в реакции гемагглютинации. Из однократно отмытых эритроцитов О, А и В, содержащих антигены М и N с наиболее высокой агглютинабельностью, взятых в день исследования у постоянных доноров, изготовляли 10% взвесь в 1% растворе альбумина (человеческого или бычьего). Сыворотки смешивали с разноименными эритроцитами на предметных стеклах, помещали во влажные камеры и слегка покачивали. Результаты учитывали микроскопически в течение 10—15 мин. Затем переходили ко второму этапу проверки в реакции абсорбции-элюции в разработанной нами модификации 1 сократив срок абсорбции до 3 ч (1 ч при 18—22° и 2 ч при 4°). Для выяснения возможного побочного связывания разноименных антител сывороток в реакции абсорбции-элюции использовали образцы крови, взятые от лиц с высокой агглютинабельностью эритроцитов М и N групп А, В, и 0 при давности пятен не более 10 дней. Активность сывороток в реакции абсорбции-элюции изучали при исследовании пятен группы MN, содержащих слабо выраженные антигены М и N давностью 3—6 мес.

Сыворотки анти-М 5 серий и анти-N 8 серий (исходный титр 1:16—1:64) были специфичными менее 7—10 мин, при разведении специфичность их снизилась до 2—5 мин. В реакции абсорбции-элюции указанные выше сыворотки в исходном титре и в разведениях (даже до 1:8—1:6) давали побочное связывание, причем в разведениях неспецифические явления усиливались.

Сыворотки анти-М 26 серий и анти-N 28 серий в неразведенном виде и в разведениях (титр от 1:64 до 1:8) оказались специфичными более 10 мин.

В реакции абсорбции-элюции сыворотки анти-М всех 26 серий в исходном титре отчетливо выявляли антиген М в крови групп М и MN, однако 2 из них с титром 1:64 и одна с титром 1:48 дали выраженное побочное связывание. В реакции абсорбции-элюции с разведением этих 3 сывороток побочное связывание сохранилось.

При использовании в реакции абсорбции-элюции сывороток анти-N 28 серий получены следующие данные:

а) с сыворотками анти-N 26 серий в исходном титре и в разведениях побочного связывания не наблюдалось. Сыворотки анти-N 2 серий в неразведенном виде (титр 1:48—1:32) с отдельными образцами крови дали побочное связывание. При разведении этих сывороток побочное связывание исчезло;

б) сыворотки анти-N 15 серий (исходный титр 1:24—1:48) в неразведенном виде выявляли антиген N в крови группы N, но не все из них в данном титре обеспечивали положительный результат с некоторыми образцами крови группы MN. После разведения физиологическим раствором сыворотки в большей степени абсорбировались антигеном N, последний выявляли не только во всех образцах группы N, но и группы MN.

Разведение сыворотки анти-N, при котором результаты реакции абсорбции-элюции были наиболее выражены, считали оптимальным. Однако разведение иммунных сывороток нередко ведет к снижению специфичности, в связи с чем их разводили перед опытом и проверяли специфичность в разведениях (в реакциях гемагглютинации и абсорбции-элюции);

в) сыворотки анти-N 13 серий (из них 3 — с титром 1:14, 7 — 1:16, 2— 1:24 и 1 — 1:32) оказались малоактивными: не обнаруживали антиген N в крови группы MN, а в некоторых случаях и в группе N. Применение оптимального разведения несколько усиливало специфические реакции — антиген N выявлялся во всех образцах крови группы N, но не был обнаружен в большинстве образцов группы MN. Эти сыворотки (13 серий) в оптимальных разведениях повторно исследовали в реакции абсорбции-элюции, но пятна крови вместо фиксации метанолом кипятили 10 мин в физиологическом растворе хлорида натрия. При таком способе сыворотки анти-N 2 серий оказались пригодными для реакции абсорбции-элюции.

Для устранения неспецифических явлений при определении групп М и N в пятнах имеет значение выбор тест-эритроцитов: кровь групп ОМ и ON, взятую от нескольких доноров, высушивали на марле и исследовали в реакции абсорбции-элюции с разноименными сыворотками нескольких серий, причем пятна не подвергали обработке. В качестве тест-эритроцитов использовали кровь тех доноров, которая в реакции абсорбции-элюции не давала побочного связывания.

Метод абсорбции-элюции в разработанной нами модификации апробировали на материале 25 экспертиз (34 образца крови и 93 пятна на вещественных доказательствах), всюду группы крови лиц, проходящих по делу, совпали по системе АВО. Большинство следов — поверхностные помарки и пятна малого размера, а в одной из повторных экспертиз материал был прислан после определения в нем видовой принадлежности крови,

Во избежание ошибок при определении групп М, N и MN в пятнах, кроме контрольных опытов с предметами-носителями и марлей, на которую взяты образцы крови лиц, проходящих по делу, исследовали пятна на вещественных доказательствах, причем элюцию вели с добавлением тест-эритроцитов, противоположных в групповом отношении использованной в фазе абсорбции сыворотки, а также образцов крови известных групп М, N и MN и выдерживали тест-эритроциты в термостате с последующей экспозицией при комнатной температуре.

В 17 экспертизах следы крови на вещественных доказательствах были дифференцированы по группе MN, в 8 — группы крови по этой системе у лиц, проходящих по делу, совпали.

Выводы

1. Из числа изученных в реакции абсорбции-элюции гетероиммунных (кроличьих) сывороток анти-М 31 серии и анти-N 36 серий, изготовленных для определения группы MN в жидкой крови, 74% сывороток анти-М и 41% анти-N оказались пригодными для исследования следов крови.
2. При введении в реакцию абсорбции-элюции сывороток с малой специфичностью или специфичных сывороток, но имеющих высокий исходный титр (1:48 и выше), наблюдали побочное связывание с разноименными антигенами.
3. Предварительная обработка пятен крови и подбор тест-эритроцитов снижали неспецифические явления.
4. Использование неразведенных сывороток анти-М не вызывало затруднений при выявлении антигена М как в крови группы М, так и MN. Следовательно, необходимость подбора оптимальных разведений в отношении сыворотки анти-М отпадает. В то Же время неразведенные сыворотки анти-N не во всех случаях выявляли антиген N в крови группы MN, наиболее активный процесс абсорбции при выявлении слабо выраженного антигена N обеспечивался определенным разведением сывороток.

Таким образом, подбор сывороток анти-М и анти-N, предварительная обработка исследуемого материала и выбор тест-эритроцитов позволяют реакцией абсорбции-элюции достоверно устанавливать группы М и N в минимальном количестве сухой крови.