К определению групп гаптоглобина в пятнах крови. Сообщение 2

Ранее мы сообщали¹, что переход комплекса гаптоглобин — гемоглобин (Hp — Hb) из пятна крови на хлопчатобумажной материи в вытяжку значительно увеличивается, если в боратно-щелочной экстрагирующий буфер ввести 5,7 М мочевины.

Целью настоящей работы было изучение влияния различных предметов-носителей на растворимость комплекса Hp — Hb и изучение подвижности комплекса Hp — Hb в зависимости от давности пятен крови.

В ходе исследования было замечено, что при экстрагировании крови из пятен на марле, нейлоне, дедероне, ацетатном и натуральном шелке, древесине, мешковине, драпе, полушерстяной материи в вытяжках часто наступало желеобразование. Скорость возникновения и выраженность его зависели от предмета-носителя, давности пятен крови и температуры окружающего воздуха. Наиболее подверженной желеобразованию оказалась кровь на марле, наименее — кровь в пятнах на хлопчатобумажной материи. Если в первом случае желеобразование наступало при экстрагировании пятен крови месячной давности, то во втором — при экстрагировании пятен крови, давность которых была более 6 мес. По мере старения пятен крови желеобразование в вытяжках возникало все чаще и вытяжки были более вязкими, чем при исследовании свежих пятен крови. Особенно быстро желеобразование наступало в тех случаях, когда пропитывание пятен крови буфером и последующее отделение вытяжки производили при температуре 22—27°.

Желеобразование затрудняло определение групп Hp, поскольку вытяжки становились вязкими и отсосать их порой было невозможно. Кроме того, во время прививки кровь не полностью переходила с фильтровальной бумаги в гель. Поэтому, прежде чем приступить к намеченным исследованиям, мы были вынуждены заняться изысканием способа предупреждения желеобразования в вытяжках.

В литературе имеется много работ о желеобразовании различных видов белков под влиянием мочевины и о его предупреждении. Однако они касаются определенных белков, например сывороточного альбумина человека, бычьего сывороточного и яичного альбумина и т. д. В соответствии с этим авторы рекомендовали предупреждать желеобразование белков с помощью того или иного реагента. При этом ряд авторов отмечают, что реагенты, повышающие устойчивость к мочевине одного белка, могут вызывать желеобразование других. Так, было установлено, что NaHP0₄ и КНР0₄ и некоторые другие соли угнетают денатурацию и повышают стабильность яичного альбумина (О.С. Цыперович, Т.О. Галкина, 1956). Прибавление натриевых солей уксусной, пропионовой, масляной и капроновой кислот ускоряет желеобразование «кислых» белков, резко тормозя этот процесс у «щелочных» белков. Фенол и бензойная кислота, действуя в щелочной среде как анионы, ускоряют застудневание «кислых» белков, замедляя структуризацию «щелочных» белков (И.М. Буланкин и соавт., 1955).

Проведенные нами исследования показали, что пропитывание пятен крови буфером и отсасывание вытяжки при температуре 4°, предварительное пропитывание пятен крови раствором бензойной кислоты, а также замена боратно-щелочного экстрагирующего буфера на фосфатный не препятствуют возникновению желеобразования в вытяжках из пятен крови.

После предварительного пропитывания пятен крови раствором каприлата натрия, а также при уменьшении количества мочевины в экстрагирующем буфере с 5,7 до 1,5 М желеобразование в вытяжках не возникало. Однако в первом случае комплекс Hp — Hb не выходил из пятен крови в вытяжку, а во втором случае часто имели место неспецифические явления, мешающие определению групп Hp.

Как видно из изложенного, ни один из перечисленных способов не может быть использован для предупреждения желеобразования в вытяжках из пятен крови.

Изучая природу денатурационной стабилизации белков, О.С. Цыперович (1959) установил, что при действии на глобулярные белки (яичный, сывороточный альбумин или эдестин) разнохарактерных денатурирующих веществ, но в недостаточно высоких концентрациях реакция не доходит до конца, она останавливается на определенных уровнях. При этом часть белка, обычно значительная, остается нативной и белок приобретает высокую устойчивость к денатурации (стабилизируется). Для того чтобы теперь вызвать денатурацию белка, воздействия должны быть значительно более сильные, чем те, под влиянием которых произошла стабилизация.

Применение принципа денатурационной стабилизации белков позволило нам предупредить возникновение желеобразования в вытяжках из пятен крови на всех перечисленных выше предметах-носителях, за исключением марли. При экстрагировании крови из пятен 6-месячной давности на марле вытяжки имели повышенную вязкость.

Практически стабилизация достигалась следующим образом. Кусочки материала размером 1,5×1,5 ом из периферических участков пятна крови размельчали ножницами на части величиной 0,4Х0,4 см. Часть материала (2—3 кусочка) помещали в пробирки с двумя каплями экстрагирующего буфера №1, содержащего 1,5 М мочевины.

Экстрагирующие буферные растворы готовят на боратно-щелочном буфере следующего состава: Н3ВО3 — 9,27 г, NaOH — 0,8 г, дистиллированной воды — до 3 л. Экстрагирующий буфер № 1: мочевины — 3 г, боратно-щелочного буфера — до 50 мл. Экстрагирующий буфер №2: мочевины — 24 г, боратно-щелочного буфера — до 50 мл. Надавливая на материал кончиком пастеровской пипетки, пропитывали его буфером и удаляли пузырьки воздуха; добавляли еще 2—3 кусочка пятна крови и т. д., после чего пробирки с исследуемым материалом помещали в холодильник. На следующий день с небольшим избытком добавляли экстрагирующий буфер №2, содержащий 8 М мочевины, вновь перемешивали содержимое пробирок и продолжали экстрагирование еще сутки при давности пятен крови не более 3 мес. Если пятно крови имело большую давность, экстрагирование продолжали 2 сут.

Гидролиз крахмала, состав гелевого и электродного буферов, реактив для проявления фракций Hp и аппарат для электрофореза описаны в сообщении 1¹. Следует лишь напомнить, что гелевый буфер перед употреблением необходимо развести в 3 раза дистиллированной водой.

Исследовано 136 образцов крови давностью от 2 мес до 1 года 2 мес. Группа Hp диагностирована во всех образцах. Независимо от давности пятен крови подвижность фракций Hp в вытяжках крови всегда соответствовала подвижности фракций Hp сыворотки жидкой крови. Интенсивность фракций Hp по мере старения пятен крови уменьшалась и к 1 году фракции Hp 2-2 и Hp 2-1, как правило, были едва заметны, особенно в тех вытяжках, которые имели повышенную вязкость (кровь на марле).

Предметы-носители не оказывали влияния на растворимость пятен крови и переход комплекса Hp — Hb в вытяжку.

Заключение

Экстрагирование крови из пятен буфером, содержащим 5,7 М мочевины, увеличивает переход комплекса Hp — Hb из пятен крови в вытяжку, но в то же время часто приводит к желеобразованию, которое препятствует определению групп Hp.

Установлено, что предварительное пропитывание пятен крови буфером, содержащим 1,5 М мочевины, стабилизирует белки крови и последующее экстрагирование крови из пятен на хлопчатобумажной и полушерстяной материи, драпе, мешковине, ацетатном и натуральном шелке, нейлоне, дедероне и древесине буфером, содержащим 8М мочевины, желеобразованием не сопровождается. Это позволило определить группу Hp в пятнах крови давностью до 1 года 2 мес (срок наблюдения) на перечисленных выше предметах-носителях.

Вытяжки из пятен крови давностью более 6 мес на марле были вязкими и определение групп Hp в них было связано с большими трудностями. В связи с этим кровь для определения групп Hp мы рекомендуем высушивать не на марле, а на хлопчатобумажной материи.

Высушивание крови и старение пятен не влияют на подвижность «стандартных фракций» Hp.

¹ Судебно-медицинская экспертиза, 1972, №2, с. 31.