Эффективность применения различных протеаз при определении видовой принадлежности труднорастворимых пятен крови

Определение видовой принадлежности крови является обязательным этапом судебно-медицинской экспертизы ее следов. Однако определение вида крови нередко затруднено из-за утраты растворимости пятен вследствие денатурации белков крови при длительном их хранении («старение» крови) и воздействия различных химических, физических и биологических факторов на кровь [1, 2, 3, 5].

В 1967 г. Р. С. Сахаров в докладе на заседании Московского научного общества судебных медиков сообщил, что применение в качестве экстрагирующей среды протеолитического фермента (протелина) улучшает растворимость пятен и позволяет уверенно определять видовую принадлежность крови в случаях, когда при экстрагировании физиологическим раствором (0,85% NaCI) «старых» (до 5 лет хранения) пятен крови не удавалось получить достаточную для наступления реакции преципитации концентрацию белка в вытяжке. На основании исследования пятен крови человека и различных животных было установлено, что ферментативный гидролиз крови оставляет реакцию видовой преципитации полностью специфичной.

В 1982 г. С.Г. Бровина предложила для определения видовой принадлежности труднорастворимых пятен крови использовать в качестве экстрагента наиболее активную протеазу животного происхождения — трипсин.

В настоящее время известен ряд протеолитических ферментов микробного (протеаза-С, проназа, каназа, триаза, термитаза) и растительного (папайи, бромелин, фицин) происхождения, которые, как и протелин, по своей ферментативной активности часто превосходят животные протеазы [9—11] и, по-видимому, могут быть эффективнее трипсина при «размачивании» труднорастворимых пятен крови.

Сравнительное изучение протеаз в этом аспекте практически не проводилось.

Целью работы явилось экспериментальное изучение эффективности применения различных протеаз при определении видовой принадлежности труднорастворимых пятен крови.

Материал и методы исследования. Пятна крови человека, обладавшие различной растворимостью (вплоть до полной ее утраты при экстрагировании физиологическим раствором), получали в результате их термической обработки при 120—140 °С (в ряде случаев при 160°С) в течение 1,5—2 ч, что в известной степени имитировало денатурацию белков крови при длительном хранении ее пятен. Изучение этих пятен крови имеет и самостоятельное судебно-медицинское значение, так как исследование их может иметь место в практике экспертизы (замытые пятна, высушенные горячим утюгом или другими сходными способами; исследование одежды, обнаруженной при пожаре и пр. ).

Изучали также возможность определения вида крови труднорастворимых пятен, обработанных кислотой (5 % H₂SO₄), щелочью (33% NaOH). 5% спиртовой настойкой йода. Пятна помещали в чашки Петри и заливали небольшим избытком указанных реактивов. При обработке щелочью и йодной настойкой воздействие реактивов продолжалось до полного высыхания пятен в комнатных условиях. Кислотой пятна обрабатывали в течение 20 мин. затем добавлением 5% NaOH (под контролем индикаторной бумаги) пятна приводили к нейтральной реакции и высушивали при тех же условиях. Перед определением видовой принадлежности крови пятна, обработанные щелочью и йодной настойкой, интенсивно промывали водой до получения нейтральной реакции или до исчезновения запаха йода. Всего исследовали 62 пятна.

При гидролизе пятен были использованы следующие протеолитические ферменты животного, микробного и растительного происхождения: трипсин («Спофа». ЧССР), каназа, протеаза-С (СССР, [6, 7]), проназа (фирма «Кальбиохэм», США), бромелин (фирма «Серлабо», Франция), папайи (фирма «Мерк», ФРГ) и папаин отечественного производства [4, 12]. Рабочие растворы папаина для развития их ферментативной активности перед использованием выдерживали в течение 20—24 ч при 4—6 °С. Перед применением в ферментных препаратах определяли протеолитическую (казеинолитическую) [16], фибринолитическую (14] и серологическую (8] активность. Препараты использовали в виде

0,1 % растворов, 0,30—0,25 мл которых заливали 20—15 мг материала пятен. Длительность экстрагирования при 4—6°С колебалась от 2,5 ч до 7 сут. В ряде опытов экстрагирование пятен крови осуществляли дистиллированной водой, 1,25% и 5 % растворами аммиака.

При определении pH экстрагирующих растворов и вытяжек из пятен использовали pH-метр (фирма «Бекман») с электродом для микроопределений. Видовую принадлежность крови в вытяжках устанавливали реакцией кольцепреципитации, выполняемой по стандартной методике; в ряде случаев для указанных целей применяли реакцию встречного иммуноэлектрофореза (электропреципитацию).

Обсуждение полученных результатов. Результаты реакции определения видовой принадлежности труднорастворимых пятен крови оказались наилучшими при использовании протеаз растительного (папаин, бромелин) и животного (трипсин) происхождения и хуже всего были при применении микробных протеаз (каназа, протеаза-С) (см. таблицу). Эти данные были неожиданными, так как микробные протеазы являются наиболее активными протеолитическими ферментами (например, в проведенных опытах активность каназы была почти в 4 раза выше протеолитической активности папаина). В связи с этим, применяя очень мягкий (низкотемпературный) гидролиз, можно было надеяться получить наилучшие результаты именно с микробными протеазами. Однако если в качестве критерия эффективности препарата использовать скорость наступления реакции преципитации, то папаин оказывается активнее каназы в 10—20 раз. Приведенные данные позволяют заметить и определенные индивидуальные особенности в действии микробных протеаз. Например, проназа (аналогом ее является отечественный протелин) была активнее других примененных микробных протеаз (каназы и протеазы-С), а при работе с некоторыми пятнами крови (пятно № 2, см. таблицу) по своей активности она приближалась к растительным протеазам или даже имела в сравнении с ними некоторое преимущество. Однако при исследовании большинства пятен крови микробные протеазы (в том числе и проназа) в целом обладали существенно меньшей эффективностью по сравнению с трипсином и растительными протеазами.

Эффективность применения различных протеаз при определении видовой принадлежности труднорастворимых пятен крови человека реакцией кольцепреципитации

Примечание. Сыворотка, преципитирующая белок человека (серия 230 Ленинградский НИИ вакцин и сывороток), с титром преципитинов 1:10 000 дает с сывороткой человека в разведении 1:1000 преципитацию к +30"; серологическую активность определяли с использованием сыворотки анти- D (серия 30. Центральный НИИ гематологии и переливания крови). Все полученные вытяжки были бесцветными. Знак «минус» означает отсутствие реакции преципитации в течение 60 мин; знак «плюс» наличие реакции преципитации, наступившей к указанным в таблице срокам (минутам, секундам).

Из таблицы также следует, что проведение гидролиза пятен крови ферментными растворами более 3 сут нецелесообразно, так как продолжение его всеми протеазами (за исключением трипсина) ведет к заметному увеличению времени появления преципитата.

При длительном гидролизе необычный эффект трипсина может быть объяснен тем, что примененный в опытах его раствор на 4-е сутки хранения сам давал отчетливо выраженную положительную реакцию преципитации с сывороткой, преципитирующей белок человека. Подобную неспецнфическую преципитацию наблюдали также и другие авторы [13, 15]. Природа и причины появления этой непостоянной реакции еще неясны, а следовательно, являются непредсказуемыми. С учетом возможности появления неспецифических результатов при использовании трипсина и большей эффективности папаина для достижения указанных целей применение трипсина для экстрагирования крови из труднорастворимых пятен представляется нецелесообразным.

С растворами растительных и микробных протеаз появление неспецифической реакции преципитации не наблюдалось ни в одном из опытов.

Результаты использования папаина для определения видовой принадлежности труднорастворимых пятен крови позволили прийти к выводу о перспективности применения этого препарата в экспертной практике. Сравнительное исследование импортных и отечественных препаратов па-панна показало, что даже неочищенные (т. е. недорогие и наиболее доступные) отечественные препараты по эффективности растворения пятен не уступают папаину фирмы «Мерк». При этом установление видовой принадлежности папаиновых гидролизатов крови может осуществляться реакциями кольцепреципитации и встречного иммуноэлектрофореза.

В настоящее время установлена возможность применения в качестве экстрагента 5 % раствора аммиака. По нашим данным, при определении видовой принадлежности значительно денатурированных пятен крови, которые не растворяются физиологическим раствором и водой, эффективность применения аммиака значительно ниже, чем ферментативного гидролиза папаином.

Известно крайне неблагоприятное воздействие на белок восстановителей (например, тиогликолята натрия), вызывающих разрыв внутренних (—S—S—) связей с нарушением нормальной конфигурации белка и потерей им иммунологической активности [17]. Вероятно, аналогичным образом действуют на белки и окислители типа йода, поскольку попытки определить видовую принадлежность обработанных раствором йода (5 % спиртовой его настойкой) пятен крови оказались безуспешными, хотя в папаиновых гидролизатах этих пятен обнаруживали довольно большое количество белка. Безуспешными оказались также попытки определить видовую принадлежность крови в пятнах, подвергшихся высокотемпературной (160°С) обработке, несмотря на то что папаиновым гидролизом их также удавалось хорошо растворить. Эти данные подтверждают приведенное в литературе мнение о том, что ферментолизаты полностью денатурированных белков видоспецифической активностью не обладают [13].

Таким образом, опыты по ферментативному гидролизу пятен крови протеазами животного, микробного и растительного происхождения в слабокислой, близкой к нейтральной среде показали, что эффективность применения протеаз при определении видовой принадлежности труднорастворимых пятен крови не связана с проявлением только какой-либо одной из активности (например, протеолитической, фибринолитической или серологической), а определяется суммой этих свойств, т. е. происхождением (видом) протеаз. Наилучшие результаты отмечены при использовании растительных протеаз (в особенности папаина). Для решения поставленных задач могут широко использоваться отечественные препараты папаина.

Успешное определение видовой принадлежности крови в пятнах, утративших растворимость вследствие денатурации белка, обусловлено наличием остаточной видоспецифической активности неденатурированных белковых молекул. При полной денатурации белка (например, при слишком высокой температуре, воздействии йода) даже при хорошем ферментативном растворении пятна видоспецифическую активность крови с помощью антисывороток к нативному белку определить не удается.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алексеев Ю. Д. // Вопросы судебно-медицинской экспертизы и криминалистики. — Горький. 1981. — С. 28—30.
2. Вагина Н. Н., Потапов М. И. // Суд. -мед. эксперт. — 1985, — №1, — С. 39—41.
3. Гаркави А. С. Материалы к определению видовой принадлежности крови в судебно-медицинской практике: (О реакции Чистовича-Уленгута и новых методах): Дис.... канд. мед. наук. — М., 1965.
4. Еркомаишвили Г. С., Россинский В. И., Костикова Е. А., Чантурия Д. Г. // Грузинская респ. науч. конф. по энзимологии:     Тезисы докладов. — Тбилиси, 1981. — С. 164—165.
5. Завадинская К. Е. // Труды судебно-медицинских экспертов Украины. — Киев. 1958. — С. 249—254.
6. Крестьянова И. Н., Васильева Л. И., Бартошевич Ю. Э. и др. // Прикладн. биохимия. — 1985. — № 2. — С. 217—225.
7. Крестьянова И. Н., Васильева Л. И.. Денякина Е. К. и др. // Там же — № 1, — С. 48—58.
8. Рассулин Ю. А., Сахаров Р. С. // Вопр. мед. химии. — 1973. — № 3. — С. 312—317.
9. Сахаров Р.С. О повышении чувствительности реакции выявления антител и антигенов некоторых изосерологических систем: Дис.... канд. мед. наук. — М.. 1968
10. Сахаров Р.С., Рассулин Ю.А., Крестьянова И.Н., Чубшева М.Д. // Пробл. гематол. — 1976. — № 9. — С. 47—49.
11. Сахаров Р. С.. Донсков С. И., Авдеева Р. А. и др. // Лаб. дело, - 1982. № 7, — С. 58(442) —60(444).
12. Чантурия Д. Г., Еркомаишвили Г. С., Россинский В. И. // Съезд фармацевтов Грузни. 1-й: Материалы. — Тбилиси, 1978. — С. 172-175.
13. Шмакова Ф. В., Каверзнева Е. Д. // Биохимия. — 1969. — Т. 34, № 3. — С. 556—563.
14. Aslrup Т.. Mulletz S. // Arch. Biochem. — 1952. —Vol. 401. — P. 342.
15. McPherson C. F. C., Neidelberger M. J. // J. amer. chem. Soc. — 1945, — Vol. 67, — P. 585.
16. Nomoto M., Narachashi Y. // J. Biochem. — 1959. — Vol. 46 - P. 653.
17. Porter R.R. // Biochem. J. — 1942. — Vol. 83, — P. 172.