О возможности использования в судебной серологии плацентарного полиморфизма щелочной фосфатазы

Исследование ферментов организма человека на изоферментном уровне, как показали многочисленные работы зарубежных и отечественных авторов, весьма перспективно при решении целого ряда судебно-медицинских вопросов. К ним, в частности, можно отнести и вопросы установления принадлежности крови, обнаруженной на вещественных доказательствах, от беременной женщины или родильницы. Такие исследования играют значительную роль в экспертизах, проводимых в связи с криминальным абортом, детоубийством с сокрытием бывших родов и в ряде других случаев. Как показали исследования А.С. Гладких (1970, 1971), Oya, Asano (1971), для этих целей может быть использован специфический фермент беременности окситоциназа (цистинаминопептидаза), изоферменты которой появляются в крови женщин в ранние сроки беременности и сохраняются некоторое время после родов в крови родильниц. Обнаружение в исследуемом пятне крови изоферментов окситоциназы решает ряд судебно-медицинских вопросов, включающих установление половой принадлежности крови, установление беременности и бывших родов (аборта), дифференцирование крови матери и плода. Однако изоферментный спектр окситоциназы, не обладающей полиморфизмом, одинаков в крови любой беременной женщины или родильницы, что в некоторой степени ограничивает экспертные возможности при решении вопроса о происхождении пятна крови от конкретного лица.

С этих позиций более перспективным, на наш взгляд, является исследование щелочной фосфатазы плаценты, которая имеет б различных фенотипов, отражающих генетически обусловленный полиморфизм плода (Robson, Harris, 1965, 1967).

Целью работы явилось изучение возможности использования плацентарных групп щелочной фосфатазы не только для судебно-медицинской диагностики беременности по пятнам крови, но и для выявления в них индивидуального плодного фенотипа этого плацентарного фермента беременности. В задачи исследования входило изучение плацентарного полиморфизма фермента среди родильниц и изучение выраженности изоферментов плацентарной фосфатазы в сыворотке крови беременных и родильниц. Нас интересовал вопрос соответствия фенотипов фосфатазы в плаценте и сыворотке крови родильниц с учетом возможности выявления индивидуальных плацентарных изоферментов в пятнах крови.

Материал и метод

Исследовали кровь и экстракты плацент 100 беременных женщин за 2—3 нед перед родами и на 6—7-й день после родов.

Экстракты плацент готовили путем микрогомогенизации кусочков плацент в бутаноле с последующим центрифугированием и исследованием надосадочной жидкости. Пятна крови от беременных женщин и родильниц готовили на марле и исследовали в течение 2 мес, используя предварительное экстрагирование бутанолом в течение суток.

Плацентарные бутаноловые экстракты, сыворотки крови беременных и родильниц и вытяжки из пятен их крови подвергали электрофоретическому разделению в геле крахмала с использованием 2 буферных систем: прерывистой трисборатной буферной системы Poulik с pH 8,6 и прерывистой трисянтарная кислота — едкий натр — лимонная кислота буферной системы с pH 6,0. Электрофорез проводили при градиенте напряжения 6—8 В/см в течение 16—18 ч в условиях холодильника. Выявление фосфатазной активности проводили с помощью субстрата бета-нафтил-фосфата и прочной синей RR соли. Инкубационная смесь состояла из 50 мл 0,06 М боратного буфера с pH 9,7, содержащего по 25 мг субстрата и азокрасителя и 60 мг хлористого магния. Инкубацию геля проводили при 37° в течение 2 ч. Для получения большей четкости фореграмм избыток красителя удаляли путем инкубации геля в растворе, содержащем метанол, ледяную уксусную кислоту и дистиллированную воду в отношении 5:1:5.

Результаты исследования

Точный диагноз всех 6 фенотипов щелочной фосфатазы плаценты, как показали проведенные исследования, возможен лишь при параллельном электрофоретическом разделении плацентарных экстрактов в 2 буферных системах при значениях pH 8,6 и 6,0. На рис. 1 схематически изображены изоферменты щелочной фосфатазы плаценты в 6 различных фенотипах (F, S, I, FS, FI, SI) в зависимости от значения pH используемых буферных систем. Из рис. 1 видно, что гомозиготные фенотипы F, S и I имеют один изофермент при обоих значениях pH, а гетерозиготные фенотипы FS, FI и SI — 3 изофермента плацентарной фосфатазы (в одном из двух значений pH буферных систем—для фенотипов FI и SI и при обоих значениях pH — для фенотипа FS). При pH 8,6 четко диагностируется лишь фенотип S, а при pH 6,0 — только фенотип F, каждый из которых (при использовании для электрофореза соответствующей буферной системы) резко отличается от 5 других фенотипов фосфатазы по электрофоретической подвижности. Точная диагностика 4 других фенотипов плацентарной фосфатазы (I, FS, FI и SI) возможна лишь при параллельном электрофорезе в 2 буферных системах.

Рис. 1. Схематическое изображение
6 фенотипов щелочной фосфатазы
плаценты при электрофорезе
в буферных системах
с различным значением pH.

Используя методику «двойного» электрофореза, нам удалось легко установить фенотипы щелочной фосфатазы во всех 100 исследованных плацентах, причем частота фенотипов была следующей: S-42, FS-35, F-12, SI-6, FI-4 и 1-1.

Исследования показали исключительно высокую активность плацентарных фосфатаз, поэтому для получения четких фореграмм бутаноловые экстракты плацент перед исследованием разводили гелевым буфером в отношении 1 : 4—5.

Исследование крови беременных женщин и родильниц показало, что обычные изоферменты сывороточной щелочной фосфатазы, характеризующие генетически детерминированные фосфатазные группы Рр 1 и Рр2, являются нечеткими и смазанными из-за появления в крови высокоактивных изоферментов плацентарной фосфатазы. Плацентарная природа этих фосфатазных изоферментов была установлена нами при помощи параллельного электрофоретического анализа сывороток крови беременных женщин (до и после родов) и экстрактов плацент, полученных после рождения ребенка. Сравнительное исследование изоферментных спектров щелочных фосфатаз из плаценты и из материнской крови в каждом конкретном случае показало значительное их соответствие, что, безусловно, доказывает плацентарную природу фосфатаз беременности. Однако четкого подразделения на 6 фенотипов фермента, наблюдаемого в плацентах, в крови родильниц и особенно беременных женщин не наблюдалось, причем интересно, что это относилось не ко всем фенотипам плацентарной фосфатазы, а лишь к некоторым. Так, используя метод «двойного» электрофореза с буферными системами при pH 8,6 и 6,0, мы смогли выявить в крови беременных женщин и родильниц три фенотипа фермента F, S и FS, соответствующих плацентарным фенотипам фосфатазы (89 случаев).

Рис. 2. Фенотипы плацентарной щелочной фосфатазы в пятнах крови беременных и родильниц (стрелкой отмечен специфичный для беременности анодный изофермент).

В то же время изоферментные спектры фосфатазы в крови родильниц, имевших плацентарные фенотипы FI, S1 и I (11 случаев), практически не различались между собой, хотя имели некоторое электрофоретическое отличие от трех других вышеперечисленных фенотипов фосфатазы.

Обращает на себя внимание тот факт, что мы не смогли установить фосфатазный фенотип в крови лишь тех беременных женщин и родильниц, у которых плацентарный фенотип фермента был FI, SI или I, т. е. был гомо- или гетерозиготен по плацентарному аллелю Р1¹. В настоящее время трудно найти убедительное объяснение этому феномену, да и исследованное количество плацент недостаточно для каких-либо категорических выводов, однако не исключена возможность, что действие этого аллеля тормозит выход плацентарной фосфатазы в кровяное русло беременных. В пользу этого предположения свидетельствует и относительно меньшая фосфатазная активность в крови родильниц, имевших плодные фенотипы щелочной фосфатазы I, SI и FI. Главным отличительным признаком фореграмм щелочной фосфатазы в крови беременных женщин и родильниц (в отличие от небеременных) явилось наличие высокоактивного медленно мигрирующего анодного изофермента плацентарной фосфатазы, отсутствующего в крови мужчин и небеременных женщин.

Исследование пятен крови от беременных женщин и родильниц, давность образования которых не превышала 2 мес, показало возможность выявления в них плацентарных изоферментов щелочной фосфатазы, которые соответствовали плодным фенотипам фермента. Однако хорошего разделения изоферментов щелочной фосфатазы при исследовании пятен крови мы не наблюдали и диагностика трех фенотипов плацентарного энзима сводилась к следующему. Фенотип F характе

ризовался одним быстрым изоферментом энзима, фенотип S — одним медленным изоферментом, а фенотип FS — одним слитым компонентом, занимающим позицию изоферментов F и S (рис. 2). Принадлежность исследуемого пятна крови от беременной женщины или родильницы устанавливалась по специфичному для беременности анодному плацентарному фосфатазному изоферменту, располагающемуся около старта.

Проведенные нами исследования показали, что плацентарный полиморфизм щелочной фосфатазы, проявляющийся в крови женщин при беременности, хотя и «смазывает» генетически обусловленный сывороточный полиморфизм энзима, все же может быть использован в судебно-медицинской практике. Выявление в пятнах крови индивидуальных плодных фенотипов плацентарной щелочной фосфатазы позволяет не только диагностировать беременность, но и имеет значение для более полной конкретизации возможности происхождения исследуемого пятна крови от определенного лица.