Диагностика прижизненности механической травмы методом диск-электрофореза

Затруднения при определении прижизненности повреждений обусловлены способностью тканей и органов к переживаемости, связанной с различной чувствительностью их к кислородной недостаточности в зависимости от степени дифференциации морфологических элементов. Выраженные макроскопические проявления прижизненности в виде обширных кровоизлияний иногда наблюдаются при механическом повреждении тканей даже через 26,5—28 ч после смерти (Н.П. Пырлина и соавт., 1973; Naewe и Bause, 1974). Не вызывает сомнений наличие тонких изменений на субклеточном уровне в виде динамики соотношений макро- и микроэлементов, активности ферментов, содержания общего белка и отдельных его фракций, подчиняющихся определенным закономерностям в живой и переживающей клетках. Регистрация этих изменений может оказаться перспективной при дифференциальной диагностике прижизненной и посмертной травматизации, что подтверждается исследованиями последних лет (Г.В. Ананьев, 1968; В.В. Филиппов и Г.А. Пашинян, 1971, и др.; Tanaka, 1966; Fazekas и Viragos, 1971; JI. Г. Шестовская, 1973). Большим преимуществом современных физических, гистохимических, биохимических методик является возможность количественной характеристики наблюдаемых явлений, что, с одной стороны, способствует объективизации экспертных выводов, а с другой — позволяет наблюдать динамику процессов во времени и служит критерием определения давности возникновения повреждений.

На возможность определения прижизненного или посмертного происхождения травмы методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) указывает Л.Г. Шестовская (1976). Мы использовали этот метод для изучения динамики процентного содержания белковых фракций скелетных мышц в области прижизненной и посмертной травмы.

Методика исследования. Травмировали резким сжатием в тисках мышцы правого бедра у белых беспородных крыс-самцов массой 200—250 г. Животных умерщвляли путем нанесения черепно-мозговой травмы. 1-ю группу крыс забили сразу после травматизации конечности, 2-ю — через 1 ч, 3-й группе травму наносили через 5 мин после смерти, 4-й — через 10 мин. после смерти. В качестве контроля использовали мышцы из симметричных участков левого бедра. Мышечную ткань освобождали от фасций, клетчатки и тщательно отмывали от крови в охлажденном физиологическом растворе, 0,5 г ткани измельчали ножницами и гомогенизировали в 2,5 мл физиологического раствора. Гомогенаты помещали в морозильную камеру холодильника по мере приготовления, чтобы исключить возможные посмертные изменения. Спустя 24 ч их размораживали при комнатной температуре и центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 30 мин. Для приготовления образца брали 15 мкл объекта над осадком, смешивали с 0,2 мл концентрирующего мономера и подвергали полимеризации под слоем электродного буфера на поверхности концентрирующего крупнопористого геля готовой для электрофореза колонки. Исследование проводили на серийном приборе для электрофореза модели 69 фирмы «Реанал» (ВНР). Белковые фракции разделяли в геле, приготовленном из рабочих растворов для буферной системы с pH 8,9, и геля 7% концентрации, прописи которых приведены в проспекте к прибору для электрофореза модели 69 фирмы «Реанал». После полимеризации геля трубки помещали в штатив прибора и заливали в верхнюю и нижнюю камеры по 1 л трис-глицинового буфера с pH 8,3. Электрофорез проводили в среднем в течение 11 ч, разделение останавливали, когда кольцо Кольрауша достигало нижнего конца трубки. Для более равномерного разделения белков в первые 30 мин сила тока была 10 мА, напряжение — 110 В, в дальнейшем силу тока увеличивали до 20 мА, напряжение — до 350 В. После окончания разделения гель извлекали из трубок и окрашивали 1% раствором амидо черного Б в течение 30 мин. Не связанный с белками краситель отмывали в 7% растворе уксусной кислоты. Количественную оценку полученных данных проводили методом прямой денситометрии на интегрирующем приборе «Хромоскан». Для уменьшения влияния сферической аберрации использовали диафрагму с точечным отверстием площадью 1 мм². Соотношение белковых фракций рассчитывали в относительных единицах.

Описанным методом получили до 14 белковых фракций, из которых на денситограммах в виде пиков зафиксированы наиболее выраженные. Для статистической обработки использовали 5 стабильно записывающихся фракций, которые обозначили цифрами 1, 2, 3, 4 и 5 в том порядке, в каком они расположены на денситограмме начиная от линии старта. Результаты исследований приведены в таблице.

Динамика белковых фракций скелетных мышц (в %)

Примечание. травм. — травмированный участок, инт.— интактный участок.

Из данных таблицы видно, что диагностические признаки прижизненности травмы имеют показатели белковых фракций 2 и 4. При сравнении процентного содержания указанных фракций поврежденного участка с интактным определяется наличие достоверной разницы, позволяющей судить о прижизненности травмы, даже возникшей непосредственно перед смертью. При травме давностью 1 ч установлено, что достоверное диагностическое значение имеют величины процентного содержания 2, 4 и 5-й фракций. При причинении механических повреждений через 5 мин (3-я группа эксперимента) и 10 мин (4-я группа эксперимента) после смерти во всех 5 фракциях не обнаружено достоверных отличий от показателей величины соответствующих фракций интактной мышечной ткани. Причем при возникновении повреждения через 10 мин после смерти вывод о посмертном происхождении его категоричен, в то время как в 3-й группе эксперимента наблюдаются еще отдельные признаки переживаемости в виде незначительного (недостоверного) увеличения процентного содержания фракции 5 в области травматизации.