Использование метода хемилюминесценции для определения прижизненности и давности механической травмы скелетных мышц

Применяя метод индуцированной ионами двухвалентного железа хемилюминесценции (XЛ), исследовали гомогенаты мышц бедра животного после механической травматизации его. Определение параметров XЛ проводили на установке по регистрации сверхслабых свечений. Установлено, что параметры индуцированной ХЛ гомогенатов травмированных мышц закономерно изменяются по мере увеличения посттравматиче-ского периода. Сопоставление их с контролем (мышцы неповрежденного бедра того же животного) позволяет сделать вывод о возможности определения прижизненности и длительности посттравматического периода при механической травме скелетных мышц.

Таблица 1. Иллюстраций 2.

Установление прижизненности и давности механической травмы остается актуальной задачей экспертной практики, несмотря на большое количество проведенных в этом направлении исследований. Интерес вызывают данные об использовании энзимной характеристики тканей и органов для определения прижизненности и давности травмы (Tanaka, 1966; Raekallio, 1973; 3. И. Сафонова, 1973, и др.). Однако широкому использованию в экспертной практике этих методик препятствует их сложность, необходимость применения дорогостоящих реактивов, субъективизм оценки выявленных изменений.

Внимание исследователей привлекает также изучаемый в последние годы феномен свечения биологических объектов, который был назван «сверхслабым свечением» (Ю.А. Владимиров, 1966). Сверхслабое свечение, возникающее при химических реакциях, называется хемилюминесценцией (ХЛ), оно обусловлено реакцией перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических объектах и регистрируется при помощи фотоэлектронного умножителя. Различают спонтанную и индуцированную ХЛ. При изучении спонтанной ХЛ было установлено, что по мере снижения жизнеспособности клеток интенсивность ее уменьшается (Б.Н. Тарусов и В.В. Перелыгин, 1966), а травма грудной клетки животных вызывает увеличение интенсивности свечения плазмы крови (А.И. Журавлев, 1975). В настоящее время при изучении реакции ПОЛ широко используется метод ХЛ, индуцированной ионами двухвалентного железа. Этот метод основан на образовании люминесцирующих продуктов в результате реакции ПОЛ. С его помощью установлено, что посмертные изменения тканей, острые хирургические заболевания органов брюшной полости влияют на кинетику ХЛ (Ю.Л. Мельников, 1974; Ю.Л. Федоров, 1974; М.Н. Молоденков и В.И. Шилов, 1974). Кинетика индуцированной ХЛ зависит от присутствия агентов, замедляющих либо ускоряющих реакцию ПОЛ (И.И. Иванов и соавг., 1971). Эти вещества могут находиться внутри клетки или образуются в ней при различных внешних воздействиях, а также при патологических состояниях и обнаруживаются своим влиянием на кинетику индуцируемой ХЛ (В.И. Оленев, 1976).

Учитывая, что повреждения, различные патологические состояния организма, переживаемость тканей влияют на кинетику индуцируемой XЛ и реакции ПОЛ, мы предприняли попытку изучить характер изменения параметров ХЛ гомогенатов механически поврежденных мышц с целью возможного использования данного метода для определения прижизненности и длительности посттравматического периода. О возможной перспективности метода ХЛ в аспекте изучаемого вопроса свидетельствует высокая стабильная чувствительность, относительно простая аппаратура, а главное возможность получать воспроизводимые результаты (Ю.А. Владимиров, 1966).

Методика исследования. Опыты проводили на белых крысах-самцах массой 150—200 г. Объектом исследования служили мышцы бедра животного. Травму наносили, раздавливая мягкие ткани бедра в тисках, конструктивные особенности которых предохраняли от травматизации кости и позволяли регистрировать силу воздействия. Животных забивали в различные сроки после травмы путем декапитации. В качестве контроля использовали мышцы бедра неповрежденной конечности того же животного. Гомогенаты готовили тотчас после смерти животного из расчета 0,5 г ткани мышцы на 5 мл 0,25 М раствора сахарозы в стеклянном гомогенизаторе. Все операции по приготовлению гомогенатов проводили при 0—4°С. В качестве среды инкубации использовали раствор, состоящий из 5 мМ трис-буфера, 5 мМ КН₂Р0₄ и 115 мМ КСl при pH 7,4. В кювету помещали 2,5 мл среды инкубации и столько же гомогената. Инициатором реакции ПОЛ служило двухвалентное железо FeS0₄-7H₂0, вводимое в кювету через полихлорвиниловую трубку до конечной концентрации 10^-4М. Измерение XЛ производили при комнатной температуре с использованием установки для регистрации сверхслабых свечений, схема которой имеется в монографии Ю.А. Владимирова и А.И. Арчакова «Перекисное окисление липидов в биологических мембранах» (1972).

Изменение параметров ХЛ в зависимости от длительности посттравматического периода (M±m)

Примечания. 1. Величина интенсивности и латентного периода дана в относительных единицах. 2. В каждой временной группе проведено 15 опытов.

Рис. 1. Типовая кривая хемилю- минесценции гомогенатов мышц, полученная в эксперименте. 1 — интенсивность свечения медленной вспышки XJI; т — латентный период XJI, отсчитываемый от момента введения ж елеза (Fe²⁺ ) до максимума «медленной вспышки» ХЛ.

Рис. 2. График изменения параметров XJT гомогенатов мышц в зависимости от длительности посттравматического периода. 1 — уровень интенсивности свечения контрольной группы мышц; 2 — изменение интенсивности свечения травми- рояанной группы мышц в зависимости от длительности посттравматического периода; 3 — длительность латентного периода в контрольной группе; 4 — длительность латентного периода в опытной группе.

Результаты исследований. Типовая кривая ХЛ, полученная в эксперименте, представлена на рис. 1. Построен график (рис. 2) и составлена таблица изменения параметров ХЛ в зависимости от длительности посттравматического периода.

Из полученных результатов видно, что амплитуда интенсивности (I) медленной вспышки ХЛ монотонно убывает в зависимости от длительности посттравматического периода. Это снижение связано с потерей жизнеспособности поврежденной ткани, при котором, возможно, начинает проявляться действие веществ, снижающих интенсивность ХЛ, так называемых тушителей. Кривая изменения латентного периода ХЛ, изображенная на графике, имеет сложный характер с максимумом в интервале 1—2 ч. Этот максимум, по всей вероятности, обусловлен реакцией организма на травму и является следствием изменения концентрации биологически активных веществ, влияющих на скорость и интенсивность реакции ПОЛ.

Таким образом, полученные результаты однозначно указывают на зависимость параметров ХЛ от длительности посттравматического периода и могут быть использованы для выработки критериев при определении давности травматизации, сопоставление их с контролем позволяет сделать вывод о возможности определения прижизненности механических повреждений скелетных мышц.