Судебно-медицинское использование полиморфизма фосфоглюкомутазы

Исследования Hopkinson и Harris (1965), Robson и Harris (1968), Lamm (1969) показали, что групповой полиморфизм фосфоглюкомутазы (К-Ф.2.7.5.1) не ограничивается эритроцитами, а присущ большинству органов и тканей, а также некоторым выделениям организма.

О возможности использования системы фосфоглюкомутазы локуса _ФГМ1 в экспертизах спорного отцовства, материнства и замены детей сообщили Fritz и Brinkmann (1969), Smerling (1972) и др. Ряд авторов показали возможность выявления групп ФГМ в пятнах крови различной давности (А.С. Гладких и А.В. Тюрин, 1975); Culliford, 1967; Brinkmann, 1969; Herzog и Sobotka, 1972), в жидкой сперме и в семенных пятнах (А.С. Гладких, 1976; Renninger и Sina, 1970; Radam и Strauch, 1971; Rees и Rotwell, 1975), в различных органах и тканях (А.С. Гладких и соавт., 1976; Culliford, 1971).

По литературным данным, результаты установления групп ФГМ в различных биологических объектах весьма разноречивы, что, видимо, можно объяснить различиями методик и условий опытов.

Целью работы явилось изучение возможности выявления групп ФГМ в крови, тканях и органах, сперме методами электрофореза в крахмальном и агаровом гелях.

Материал и метод. Исследовали образцы крови от 140 не связанных родством лиц, сперму 46 здоровых мужчин, а также ткани и органы 22 трупов. Гемолизаты эритроцитов готовили с помощью четыреххлористого углерода, лизаты сперматозоидов — многократным замораживанием и оттаиванием, гомогенаты органов и тканей — микрогомогенизацией с равным объемом физиологического раствора. Пятна крови и спермы готовили на хлопчатобумажной ткани и хранили при комнатной температуре, гомогенаты органов и тканей хранили в замороженном состоянии. Электрофорез в геле крахмала проводили по методике Spencer и сотр. (1964) с использованием непрерывной буферной системы: переходный буфер — 0,1 М трис, 0,1 М малеиновая кислота, 0,01 М ЭДТА, 0,01 М хлористый магний, pH 7,4. Для геля использовали переходный буфер в разведении 1:10. Электрофорез проводили в течение 18 ч в холодильнике с ингредиентом напряжения 4 В/см. Электрофорез в геле агара проводили по методике Мопп (1968), используя 1% агаровый гель и фосфатную буферную систему, pH 7,5 (0,0056М К2НРО4, 0.0022М NaH₂P0₄). Продолжительность электрофореза 3 ч при ингредиенте напряжения 8 В/см в холодильнике. Для выявления ФГМ-активности применяли инкубационную смесь, содержащую 200 мг глюкозо-1-фосфата, 20 мг НАДФ, 20 мг феназинметасульфата, 20 мг тетразолиевого МТТ, 10мкл глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 200 мг хлористого магния в 70 мл трис-НС1-буфера (0,2 М, pH 8,0). Время инкубации 1—2 ч при температуре 37°С.

Результаты исследования. В свежем биологическом материале (гемолизаты, эритроцитов, цельная сперма, лизаты сперматозоидов, гомогенаты незагнивших органов и тканей) активность фермента была достаточно высокой, что позволило, используя метод электрофореза в крахмальном геле, дифференцировать типы ФГМ во всех 208 исследованных объектах.

При этом частота встречаемости типов ФГМ была следующей. В крови: ФГМ-1 — 66, ФГМ-2-1—49, ФГМ-2 — 25; в сперме: ФГМ-1— 24, ФГМ-2-1 — 16, ФГМ-2 — 6; в органах и тканях: ФГМ-1 — 12, ФГМ-2-1 — 7, ФГМ-2 — 3. Встречаемость типов ФГМ в 208 исследованных образцах составила для ФГМ-1 50%, для ФГМ-2 15%, для ФГМ-2-1 35%. Наивысшей активностью обладала тканевая ФГМ, несколько меньшей — ФГМ спермы, в крови она была еще ниже (рис. 1, см. вклейку). Почти все органы и ткани организма пригодны для типизации по группам ФГМ. Группы ФГМ определялись нами в скелетной мускулатуре, печени, почке, селезенке, сердце, легких, мозге, поджелудочной железе, щитовидной железе, надпочечнике, желудке и кишечнике. Наивысшей активностью обладал фермент скелетной мускулатуры, его активность была в 10—15 раз выше, чем в эритроцитах. Поэтому для лучшего выявления типов ФГМ перед электрофорезом надосадочную жидкость из гомогенатов мышц приходилось разводить гелевым буфером в соотношении 1:8—1:10. Гнилостное изменение мышц хотя и снижало активность ФГМ, однако выявление групп фермента было возможным почти во всех случаях. Особенно важным было то, что такая возможность сохранялась даже в тех случаях, когда во всех паренхиматозных органах и в крови дифференцирование групп ФГМ из-за гнилостного изменения было затруднительным.

Во всех исследованных образцах цельной спермы и лизатах сперматозоидов четко выявлялись изоферменты ФГМ, однако активность их в различных образцах была неодинаковой. Изоферменты ФГМ спермы в типах ФГМ-2 и ФГМ-2-1 были тождественны эритроцитарным, в то же время в сперме типа ФГМ-1 наблюдалась добавочная зона ФГМ-активности, отсутствующая в гемолизатах эритроцитов. Эта особенность, наблюдаемая во всех образцах спермы с типом ФГМ-1, не препятствовала, однако, четкой дифференцировке всех трех типов фермента.

Исследование пятен спермы показало достаточную устойчивость фермента. В большинстве их типы ФГМ устанавливались через 4— 6 нед, а в некоторых образцах (преимущественно с типом ФГМ-1) — через 7—8 нед. Для лучшего выявления групп ФГМ в пятнах спермы перед приготовлением крахмального или агарового геля добавляли в гелевый буфер 20—30 кг кофермента НАДФ, а также увеличивали срок инкубации гелевого блока в растворе красителя до 2¹/₂—3 ч.

В гемолизатах эритроцитов активность ФГМ была ниже, чем в органах, тканях и сперме, но все же достаточной для выявления типов фермента. Присутствие стромы слегка смазывало изоферментный спектр ФГМ, поэтому перед электрофорезом гемолизаты длительно центрифугировали и исследовали надосадочную жидкость. Добавление к эритроцитам СС1₄ способствовало быстрому их разрушению и отделению стромы и не снижало ферментативную активность.

Генетически обусловленный полиморфизм ФГМ использовали в 38 экспертизах спорного отцовства, причем в 3 из них отцовство исключили по типам ФГМ и другим генетическим признакам крови, а в одной — только по ФГМ.

В пятнах крови типизация групп ФГМ была возможной только при давности их образования 2—3 нед, а в корочках крови на невсасывающем материале активность фермента сохранялась дольше (в некоторых случаях 1 мес и более). Во всех случаях при исследовании пятен крови до образования геля в гелевый буфер вводили кофермент НАДФ, который повышал чувствительность реакции.

Для сравнения материал подвергли электрофорезу в геле агара, поскольку доступность метода, простота и относительная быстрота делали целесообразным изучение возможности его использования для установления типов ФГМ в судебно-медицинских целях.

Оказалось, что электрофорез в агаровом геле в определенных случаях можно использовать для типизации групп ФГМ в биологическом материале. Это относится прежде всего к свежему биологическому материалу, имеющему достаточно высокую ферментативную активность ФГМ (гомогенаты незагнивших тканей и органов, цельная сперма и лизаты сперматозоидов, гемолизаты эритроцитов).

Обладая меньшей разрешающей способностью, метод электрофореза в геле агара оказался менее пригодным для установления типов ФГМ в пятнах спермы и крови, в которых активность фермента ниже. Это объясняется еще и тем, что из-за значительной разницы в толщине крахмальных и агаровых блоков количество проб, вносимых в гель агара, несравненно меньше тех, которые вносят в крахмальный гель. Использование же более толстых агаровых блоков нецелесообразно, поскольку при этом снижается их разделяющая способность. На рис. 2 (см. вклейку) представлена фореграмма изоферментов ФГМ в пятнах крови, полученная после электрофореза в геле агара с внесением в него кофермента НАДФ. Она показывает, что даже в одинаковых условиях опыта при исследовании пятен крови одной и той же давности разделение изоферментов ФГМ в вытяжках из различных пятен крови, а следовательно, и возможность диагностики типов ФГМ неодинаковы.

Выводы

1. Выявление типов фосфоглюкомутазы возможно как в свежем материале (кровь, сперма, органы и ткани), так и в пятнах крови и спермы.
2. Среди 208 изученных биологических объектов частота фенотипов фосфоглюкомутазы составила для ФГМ-1 50%, для ФГМ-2-1 35%, для ФГМ-2 15%.
3. Благоприятная частота распределения аллелей ФГМ¹ и ФГМ², контролирующих группы фосфоглюкомутазы локуса ФГМ_Ь делает эту систему исключительно перспективной в судебно-медицинских исследованиях биологических объектов.
4. Сравнительное исследование электрофореза в гелях крахмала и агара, используемых для типизации групп ФГМ, показало преимущества крахмального геля.

Рис. 1. Фореграмма фосфоглюкомутазы в крахмальном геле.
1—3 — ФГМ в геыолизатах эритроцитов; 4—6 — ФГМ в скелетной мускулатуре; 7—8 — ФГМ в сперме.

Рис. 2. Фореграмма фосфоглюкомутазы в вытяжках из пятен крови трехнедельной давности (агаровый гель).
В центральных образцах тип ФГМ не определен из-за плохого разделения изоферментов.