Изготовление сывороток анти-Gc на основе производства кроличьих сывороток, преципитирующих белки крови человека

При определении групп изосерологической системы Gc широко используют имму-лоэлектрофорез (Hirschfeld, 1960; Е.А. Ильина, 1972), электрофорез в крахмальном геле (Schultze и соавт., 1962; Arfors и Beckman, 1963; В.А. Спицин и О.В. Ирисова, 1973), в полиакриламидном геле (Kitchin, 1965; М.О. Тер-Маркарьян и Э.Г. Ларский, 1966; Н.Н. Старостин, 1975) и на целлюлозоацетатных пленках (Geserick и Schneider, 1959). Фирма «Миллипор» рекомендует применять для иммуноэлектрофореза целлюлозоацетатную пленку с «Panageb, который увеличивает разрешающую способность метода.

Для диагностических целей при определении групп изосерологических систем Gc, Нр (гаптоглобина), Ср (церулоплазмина) и др. нужно проводить исследования, используя различные методы электрофореза.

Для установления групп Gc человека методом ИЭФ необходимы гетероиммунные диагностические сыворотки анти-Gc.

Антитела анти-Gc удовлетворительно вырабатываются в организме кроликов (Hirschfeld, 1959; Engelhard, 1970), коз (Kerde и соавт., 1962; фирма «Biotest, 1974) и лошадей (Bundschuh и Krause, 1965).

В качестве антигена для иммунизации применяли очищенную и обогащенную субстанцию Gc из асцитной жидкости с определенным типом Gc (Engelhard, 1970), «i-фракцию сыворотки человека (Schultze и соавт., 1962), смесь сывороток лиц группы 0, абсорбированных на каолине (Hirschfeld, 1959). Turowska и Turowski (1965) использовали человеческую сыворотку с адъювантом, состоящим из эндотоксина Е. coli и фракции очищенного липополисахарида.

А.К. Туманов (1968) исследовал 18 серий сывороток, преципитирующих белок человека, изготовленных в сывороточном отделе Научно-исследовательского института судебной медицины, и нашел 3 серии с антителами анти-Gc.

Целью настоящей работы было изготовление гетероиммунных сывороток анти-Gc.

Материал и метод

Для получения количественно достоверных результатов иммунизировали кроликов породы шиншилла. Была использована схема иммунизации, постоянно применяемая в сывороточном отделе Научно-исследовательского института судебной медицины для изготовления гетероиммунных сывороток, преципитирующих белок крови человека. В 1, 3 и 5-й дни иммунизации антиген вводили кроликам внутривенно по 1 мл. Первую-реиммунизацию проводили спустя 26 дней от начала иммунизации 2 мл сыворотки внутрибрюшинно, а через день 1 мл антигена вводили внутривенно. Последующие реиммунизации осуществляли через 1—6 мес по той же схеме.

В качестве антигена использовали нормальную человеческую сыворотку без учета группы по системе Gc (117 кроликов —1-я экспериментальная партия) и с учетом ее (60 кроликов — 2-я экспериментальная партия). Сыворотки с учетом группы по системе Gc были подобраны от 112 доноров Московской городской станции переливания крови с помощью гетероиммунных кроличьих сывороток анти-Gc, изготовленных нами

Наличие антител анти-Gc в иммунных неабсорбированных сыворотках определяли методом иммуноэлектрофореза по Scheidegger (1955) в модификации Hirschfeld.

Сила тока 35—40 мА (на каждую пластину размером 13X18 см), время электрофореза 1¹/₂—2 ч.

В каждый опыт вводили 3 сыворотки микродоноров института с известной группой по системе Gc. Результаты учитывали после 18—20 ч экспозиции во влажной камере при температуре 37°.

Титр антител анти-Gc устанавливали методом ИЭФ с разведениями иммунной сыворотки 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:10, 1:12 и т. д.

Титр преципитинов в иммунных неабсорбированных кроличьих сыворотках определяли реакцией кольцепреципитации по Чистовичу — Уленгуту с разведениями антигена 1:1000, 1:5000, 1:10 000.

Результаты

Антитела анти-Gc были выявлены в крови 48 кроликов из 177.

Из 117 кроликов, иммунизированных нормальной сывороткой крови человека без; учета группы Gc, антитела анти-Gc выработали 35 животных, а из 60 кроликов, иммунизированных с учетом группы Gc, — 13. Незначительное превышение количества кроликов, выработавших антитела анти-Gc после иммунизации их подобранной заранее сывороткой, не может быть учтено, поскольку в эту экспериментальную партию вошли животные, уже являющиеся продуцентами преципитинов и претерпевшие более 2 реиммунизаций. По мере увеличения длительности иммунизации в, целом увеличивалось количество животных с антителами анти-Gc. В то же время в процессе реиммунизации животные вырабатывали побочные преципитины, реагирующие, в частности, с белковыми фракциями, расположенными в зоне Gc. Интенсивность этих линий преципитации тоже возрастала.

Из 48 сывороток, содержащих антитела анти-Gc, только 13 были пригодны без абсорбции для тестирования сывороток крови человека по системе Gc, остальные нуждались в абсорбции побочных преципитинов (см. таблицу).

Одновременное присутствие в пригодных сыворотках антител к альбумину, трансферрину или а₂-макроглобулину не мешало диагностике групп Gc в сыворотке крови человека.

Сыворотки кроликов 2-й экспериментальной партии (иммунизированные с учётом группы Gc ), содержащие антитела анти-Gc, позволяли одинаково эффективно диагностировать все группы Gc вне зависимости от того, сыворотка какой группы была применена для иммунизации.

Мы исследовали иммунные сыворотки, преципитирующие белок человека с титром преципитинов 1 : 10 000 и менее. Из 95 сывороток, титр которых в реакции кольцепреципитации был менее чем 1 : 10 000, антитела анти-Gc были выявлены в 12 сыворотках. Было отмечено, что сыворотки, преципитирующие белок крови человека с низким титром, часто содержат антитела только к одной из белковых фракций и являются моноспецифическими.

Титр антител анти-Gc исследованных сывороток находился в диапазоне 1:2—1:15 и не зависел от титра преципитинов, определенного в реакции кольцепреципитации.

Ряд серий иммунных сывороток анти-Gc проверили на сохраняемость антител анти-Gc. Большинство сывороток были пригодны для диагностики групп Gc в жидкой крови в течение 1 - 1 ¹/₂ лет.

Выводы

1. Показана возможность изготовления сывороток анти-Gc на основе производства кроличьих сывороток, преципитирующих белок человека, что снижает себестоимость сывороток анти-Gc и повышает эффективность производства.
2. Оптимальный диапазон длительности иммунизации кроликов с целью изготовления сывороток анти-Gc при условии их использования без абсорбции находится в пределах 1—9 мес.
3. При иммунизации животных нормальной сывороткой человека не обязателен подбор ее по группе Gc.