Сравнительная оценка результатов некоторых методов и их модификаций, используемых для определения фенотипов системы Gc

Методы диагностики фенотипов системы Gc можно разделить на 2 группы: к 1-й относятся методы электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле (ПААГ), ко 2-й — методы электрофоретического разделения сыворотки крови в агаровом геле или на целлюлозоацетатных пленках с последующим выявлением иммунологических особенностей белка Gc посредством реакции преципитации при помощи сыворотки анти-Gc. Методы электрофореза в крахмальном геле и иммуноэлектрофореза на целлюлозоацетатных пленках не нашли широкого применения для диагностики фенотипов системы Gc в судебно-медицинских целях. Наибольшее распространение получил метод иммуноэлектрофореза в агаровом геле. Электрофорез в ПААГ находится в стадии разработки и применяется в основном при популяционных исследованиях.

Методика иммуноэлектрофоретического определения фенотипов системы Gc едина, общеизвестна и состоит в следующем: исследуемые сыворотки человека электро-форетически разделяют в 1 % агаровом геле на мединал-вероналовом буфере pH 8,6, затем в геле вдоль оси миграции сыворотки вырезают канал, в который вводят сыворотку анти-Gc. Во время инкубации происходит встречная диффузия разделенной исследуемой и преципитирующей сыворотки. В результате образуются соответствующие тому или иному фенотипу Gc полосы преципитации.

В настоящее время опубликовано более 500 статей, посвященных исследованию сывороточной системы Gc. Почти все исследования были проведены методом иммуноэлектрофореза в агаровом геле. Это объясняется высокой специфичностью, чувствительностью метода, простотой получения агарового геля, хорошей воспроизводимостью результатов при наличии необходимой для иммуноэлектрофореза сыворотки анти-Gc.

В последние годы все большее распространение получает метод электрофореза в ПААГ при проведении биохимических, клинических и судебно-медицинских исследований. Это объясняется простотой, высокой разрешающей способностью и чувствительностью метода (чувствительность электрофореза в ПААГ можно сравнить лишь с чувствительностью метода иммуноэлектрофореза), хорошей воспроизводимостью результатов; метод не требует дорогостоящей аппаратуры и диагностических сывороток.

В 1965 г. Kitchin предложил метод электрофореза в ПААГ для диагностики фенотипов системы Gc. Использован аппарат с охлаждающим устройством. Электрофорез проводили в 5% ПААГ с добавлением цианогум-41. Использовали два варианта трис-ЭДТА-боратного буфера pH 8,28 и 8,91. Оптимальные результаты Kitchin получил при использовании буферного раствора pH 8,28 и времени электрофореза 5 ч. При этом на фореграммах сыворотки групп Gc 1—1 были представлены в виде двух быстро движущихся полос, Gc 2—2 — в виде двух медленно движущихся полос, a Gc 2—1—в виде трех полос, содержащих как медленно, так и быстродвижущиеся компоненты.

По данным Н.А. Добротиной и соавт. (1974), при электрофоретическом разделении сыворотки крови человека методом электрофореза в ПААГ с использованием трис-боратного буферного раствора (pH 8,3) в постальбуминовой области выявлялось от 3 до 7 фракций. При этом достоверно диагностировался только фенотип Gc 1—1, который характеризовался двумя быстрыми и двумя-тремя медленными фракциями. Фенотипы Gc 2—1 и Gc 2—2 характеризовались большим количеством фракций, вследствие чего авторам не всегда удавалось диагностировать их.

В 1975 г. Н.Н. Старостиным предложена модификация определения фенотипов системы Gc методом электрофореза в ПААГ с использованием трис-глицинового буфера pH 8,3. Время электрофореза составило 40—45 мин. Для более качественного разделения белков Gc Н.Н. Старостин рекомендует исследуемую сыворотку инкубировать с раствором гемоглобина, избегая ее перенасыщения. Окраска гелевых столбиков производится поэтапно: вначале фиксирование геля в трихлоруксусной кислоте,, затем троекратное отмывание геля в дистиллированной воде и последующее окрашивание в кипящей водяной бане в растворе амидо черного. По данным автора, фенотип Gc 2—2 характеризуется одной медленно мигрирующей фракцией и как исключение в непосредственной близости от нее может располагаться едва заметная фракция II-а; для Gc 2—1 характерны две фракции равной интенсивности, имеющие быстро и медленно движущиеся компоненты. Весьма редко эта разновидность Gc может иметь едва заметный третий компонент III-b, обладающий большей скоростью миграции. В редких случаях в непосредственной близости к альбумину можно выявить едва заметную фракцию IV-a.

Мы апробировали методику Kitchin, использовав аппарат фирмы «Reanal» без охлаждающего буфер устройства. В качестве переходного буфера применяли рекомендуемый Kitchin трис-ЭДТА-боратный буфер с pH 8,28. К сожалению, состав исходных буферов в статье не приведен, поэтому мы применили широко распространенный трис-ЭДТА-боратный буфер по прописи, предложенной Davis (1964). Время электрофореза 2,5—3,5 ч при силе тока 2 мА на трубку в первые полчаса и 5 мА в последующем. Более подробно методика изложена в предыдущем сообщении¹.

Для получения оптимальных результатов разделения белка Gc на фракции были изучены: 1) различные количества исследуемой сыворотки, 2) длина электрофоретического разделения сыворотки крови человека (для этой цели были использованы стеклянные трубочки длиной 10 и 12 см), 3) способы внесения исследуемой сыворотки, 4) различные сорта амидо черного Б и время окраски, 5) способы отмывания. В результате установлено, что оптимальное количество исследуемой сыворотки в смеси с 40% сахарозой в отношении 2 : 1 равно 0,04 мл; стеклянные трубочки можно применять длиной как 10, так и 12 см. Исследуемые сыворотки нужно подслаивать после установления геля в аппарат для электрофореза и заполнения камер переходным буфером. Удаление геля из трубочек является кропотливой операцией и ее лучше производить при помощи шприца с иглой из нержавеющей стали с отшлифованным концом. После заполнения шприца водой иглу медленно вводят вращающим движением между стенкой трубочки и гелем. Вода отслаивает гель от трубочек, и гелевый столбик извлекается. При использовании амидо черного Б различных партий получается различный эффект окраски. Краситель может быть приготовлен на 7% растворе уксусной кислоты, на ледяной уксусной кислоте с добавлением или без добавления метанола. Оптимальные результаты мы получали при использовании амидо черного с добавлением метанола и ледяной уксусной кислоты. При этом гелевые столбики получались более прозрачными, а полосы были видны более четко (время окраски 10 мин). Хорошие результаты получены при окраске 1% раствором амидо черного в 7% растворе уксусной кислоты (время окраски 15—30 мин). Следовательно, для каждой партии красителя нужно подбирать оптимальные условия. Приготовленный краситель может храниться до 1 го да. Изучено два способа отмывания: электрофоретический и основанный на явлениях диффузии. Электрофоретическое отмывание проводилось в течение от 10 мин до 1 ч при силе тока от 600 до 50 мА. При этом результаты были неудовлетворительными — наблюдалось либо полное обесцвечивание геля в постальбуминовой области, либо недостаточное отмывание. Поэтому мы предпочли отмывание в 7% растворе уксусной кислоты. Это отмывание было более щадящим, но по времени более длительным. Хранить гелевые столбики рекомендуется в 7% растворе уксусной кислоты.

Отработку методики проводили на образцах сыворотки крови с заведомо известными группами Gc. После этого 96 образцов сыворотки крови с неизвестными группами Gc исследовали двумя методами: электрофореза в ПААГ и иммуноэлектрофореза в агаровом геле. Различий в диагностике Gc не наблюдали. При этом на фореграмме при электрофорезе в ПААГ белок Gc 1—1 разделялся на две быстро движущиеся фракции, Gc 2—2 — на две медленно движущиеся фракции, a Gc 2—1 — на три фракции, содержащие быстро и медленно движущиеся компоненты (см. рисунок).

При сравнении результатов, полученных при использовании различных модификаций метода электрофореза в ПААГ, установлено, что качество разделения белка Gc на фракции различно.

Классическое разделение белка Gc получается по методу Kitchin и разработанной на его основе нашей модификации. По модификации Н.А. Добротиной и соавт., как указывают сами авторы, дифференцирование групп Gc 2—2 и Gc 2—1 удается не всегда. Большое количество фракций белка Gc, по нашему мнению, получается в результате неправильной расшифровки фореграммы, когда некоторые белковые фракции, находящиеся в области а2-глобулинов, расценивают как фракции белка Gc. О качестве разделения белка Gc на фракции по данной методике мы судить не можем, так как приведенные фореграммы очень слабо выражены и нечетки.

Наличие едва заметных, не всегда проявляющихся полос при модификации Н.Н. Старостина свидетельствует о недостаточной воспроизводимости результатов и неполном разделении белка Gc на фракции, что подтверждается данными Parker и соавт. (1963) и Bearn и соавт. (1964).

Parker, Cleve и Bearn при применении электрофореза в крахмальном геле получили фореграмму, близкую к фореграмме Н.Н. Старостина. При этом авторы подчеркивают, что наличие слабых, дополнительных, не всегда проявляющихся полос может привести к ошибке в диагностике фенотипов Gc и рекомендуют свой метод для диагностики редких фенотипов этой системы. Введение же в буфер гидрооксида лития, по данным Bearn, Kitchin и Bowman, улучшает электрофоретические условия и дает возможность четко дифференцировать основные фенотипы системы Gc. При этом фенотипы Gc 1—1 и Gc 2—2 характеризуются двумя ясно различными фракциями, а фенотип Gc 2—1 — тремя фракциями почти равной интенсивности.

При сравнении методов иммуноэлектрофореза в агаровом геле и электрофореза в ПААГ, применяемых для диагностики фенотипов системы Gc, в настоящее время трудно сказать, какой из этих методов имеет большие преимущества. Во всяком случае ясно, что они не исключают друг друга и каждый из них имеет свои преимущества и трудности. Определение фенотипов Gc с помощью иммуноэлектрофореза позволяет исследовать одновременно до 20 образцов сывороток крови, а с помощью электрофореза в ПААГ — 12. При иммуноэлектрофорезе все образцы исследуемых сывороток находятся на одной пластинке, при электрофорезе в ПААГ каждая сыворотка разделяется как бы в отдельном блоке, который впоследствии нужно отдельно окрашивать л отмывать, что менее удобно. Кроме того, не исключена возможность повреждения гелевого столбика при извлечении геля из стеклянных трубочек. Оба метода позволяют диагностировать фенотипы Gc в 90% случаев при первичном исследовании. В то же время метод электрофореза является незаменимым в тех случаях, когда производство сывороток анти-Gc для всех судебно-медицинских лабораторий еще не налажено. Наличие двух методов особенно желательно, если получаются сомнительные результаты при использовании одного из методов я встречаются редкие варианты фенотипов системы Gc.

По нашему мнению, метод электрофореза в ПААГ можно применять для судебно-медицинских целей в тех случаях, когда на форе-грамме выявляются все основные фракции Gc в классическом виде, т. е. для фенотипов Gc 1—1 и Gc 2—2 — по две фракции, а для Gc 2—1—три фракции равной или почти равной интенсивности. При меньшем количестве фракций и появлении дополнительных правильность диагностики фенотипов Gc сомнительна и требует обязательного исследования этих образцов сыворотки крови методом иммуноэлектрофореза в агаровом геле.

¹ Первый Всесоюзный съезд судебных медиков (Тезисы докладов). Киев, 1976, с. 481—482.