Сравнительная оценка новых методов дифференцирования крови филогенетически близких видов животных

В судебно-медицинской практике для дифференцирования белка филогенетически близких видов животных при экспертизе пятен крови используют реакцию преципитации в жидкой среде. Применяют специальные дифференцирующие сыворотки, полученные иммунизацией животных каким-либо видом белка. Однако эти сыворотки не являются строго специфичными, они позволяют дифференцировать родственные виды белка только по скорости наступления реакции, которая в значительной степени зависит от концентрации белка-антигена в исследуемом пятне. Технические погрешности в определении количества белка, субъективная оценка времени появления преципитата и некоторые другие факторы могут искажать результаты опыта.

В.И. Чарный (1964—1968) для целей дифференцирования филогенетически близких видов белка предложил 3 модификации реакции преципитации в геле: сравнительную реакцию преципитации в агаре, реакцию торможения преципитации в агаре и иммуноэлектрофорез. Для этих тестов можно использовать обычные преципитирующие сыворотки.

В судебно-медицинской литературе отсутствуют работы по проверке и сравнительной оценке этих методов. Поэтому целью настоящей работы явилось выяснение и сопоставление пределов чувствительности разрешающей способности этих методов.

Сравнительную реакцию преципитации, реакцию торможения преципитации в агаре и иммуноэлектрофорез проводили по методикам, предложенным В.И. Чарным. ¹

Первая серия экспериментов была посвящена сопоставлению чувствительности 3 изучаемых реакций в агаре, для чего устанавливали предельные разведения белков, при которых еще можно было определить их антигенные различия. Опыты проводили с нормальными сыворотками (антигенами) коровы, барана и лося от нескольких особей в разведении от 1:32 до 1:6000 и преципитирующими сыворотками, изготовленными в Институте судебной медицины и в Ленинградском институте вакцин и сывороток путем иммунизации кроликов белком барана, коровы или лося (всего 10 серий). Используемые преципитирующие сыворотки в процессе изготовления не подвергались абсорбции чужеродными антигенами. Наши исследования показали, что такие сыворотки обеспечивают лучшие результаты при дифференцировании родственных белков, чем обычные абсорбированные сыворотки.

Всего проведено опытов: сравнительной реакции преципитации — 118, реакции торможения преципитации — 378, иммуноэлектрофореза—44.

Как и следовало ожидать, чувствительность реакций зависела от титра преципитирующих сывороток, который устанавливали преципитацией в агаре. Так, например, при титре сывороток в агаре 1:8000— 1:9000 удавалось дифференцировать белки коровы и барана сравнительной реакцией преципитации в разведении 1:900—1:1000, с помощью реакции торможения преципитации— 1:4000—1:5000, а иногда — 1:6000. Сыворотки, имевшие титр 1:4000—1:6000, позволяли различать белки тех же животных при постановке реакции сравнения, как правило, в разведении 1:500—1:600 и лишь в единичных опытах— 1:1000. Реакция торможения преципитации с этими сыворотками выявляла антигенные различия белков коровы и барана в разведении от 1:1000 до 1:4000. Указанные концентрации белка являются предельными. Оптимальные разведения для сравнительной реакции преципитации равны 1:200—1:300, а для реакции торможения преципитации— 1:700—1:900, в зависимости от титра используемой сыворотки.

Чувствительность метода иммуноэлектрофореза оказалась гораздо ниже чувствительности первых двух реакций. Антигенные различия сывороточных белков коровы и барана определяли лишь при разведении в 70—80 раз с помощью неабсорбированной сыворотки, преципитирующей белок крупного рогатого скота высокого титра (в агаре 1:8000).

Таким образом, при дифференцировании белков близкородственных животных чувствительность реакции торможения преципитации в агаре в 3—4 раза превышает чувствительность сравнительной реакции преципитации и в 40—50 раз выше чувствительности метода иммуноэлектрофореза.

Следующая серия опытов имела целью сопоставить разрешающую способность сравнительной реакции преципитации в агаре и реакции торможения преципитации в агаре. Определять разрешающую способность метода иммуноэлектрофореза мы посчитали нецелесообразным, так как опыты требуют большого количества сыворотки (более 0,5 мл на один опыт), а чувствительность метода довольно низкая.

Разрешающую способность метода оценивали по возможности дифференцирования близких видов, т. е. считали ее тем выше, чем более близкие виды животных удавалось дифференцировать с помощью той или иной реакции.

Возможность дифференцирования выясняли в опытах с нормальными сыворотками крови нескольких особей коровы, барана и лося в разведении 1:300, утки, лебедя, павлина, 3 видов кур и 3 видов фазана (королевского, золотого и серебристого) в разведении от 1:100 до 1:500, а также со свежими пятнами крови коровы, барана и лося с концентрацией белка в вытяжках из пятен в разведении 1:100—1:300. Использовали сыворотки, преципитирующие белки крупного, мелкого рогатого скота, лося, курицы и утки. Всего проведено опытов: с нативными сыворотками животных сравнительной реакцией преципитации 437, реакцией торможения преципитации 522; с пятнами крови коровы, барана и лося сравнительной реакцией преципитации — 36 и реакцией торможения преципитации — 20.

Установили, что реакция торможения преципитации в агаре позволяет более четко дифференцировать кровь коровы, барана и лося, чем сравнительная реакция преципитации, а при исследовании крови птиц реакцией торможения преципитации в агаре можно различать белки филогенетически близких видов животных нескольких родов семейства куриных (курицы, фазана, павлина) и семейства водоплавающих (утки, лебедя), тогда как сравнительной реакцией преципитации можно отличить лишь кровь водоплавающих птиц от крови птиц семейства куриных.

Выводы

Сравнительная реакция преципитации в агаре, реакция торможения и иммуноэлектрофорез являются простыми и объективными методами дифференцирования крови филогенетически близких видов животных, при этом можно использовать неабсорбированные преципитирующие сыворотки.

Реакция торможения преципитации наиболее чувствительная и обладает более высокой разрешающей способностью. Заслуживает внимания и сравнительная реакция преципитации в агаре, обладающая достаточной чувствительностью, разрешающей способностью и требующая меньше времени, чем реакция торможения преципитации.

Иммуноэлектрофорез, хотя и демонстративен, но уступает в чувствительности первым двум методикам, более трудоемок и требует большего количества преципитирующих сывороток, что снижает его практическую ценность.

¹ Чарный В.И. Установление видовой специфичности белков крови. М., «Медицина», 1976.