Установление видовой принадлежности крови реакцией преципитации с регистрацией на хроматографической бумаге

Пятна, содержащие малое количество крови (небольшие по размеру, слабо насыщенные, замытые), а также большой давности не всегда пригодны для установления видовой принадлежности крови путем реакции преципитации в обычном варианте. В таких случаях рекомендуют применять сыворотки высокого титра, реакции связывания комплемента или анафилаксии. Нередко эксперты вообще отказываются определять видовую принадлежность крови.

В 1955 г. А.Е. Гурвич предложил реакцию преципитации на хроматографической бумаге, нанося изучаемый антиген и соответствующую антисыворотку на один и тот же участок бумаги. Преципитат, выпадающий на этом участке, отмывают от непрореагировавших белков током растворителя.

А.С. Гаркави в качестве антигенов применила нормальные сыворотки и вытяжки из пятен крови человека и животных, а в качестве антител — преципитирующие сыворотки на белок человека и животных. Она использовала метод нисходящей хроматографии с однократным пропусканием тока растворителя. Белок вытяжек и сывороток в разведении 1:1000 и особенно белок преципитирующих сывороток прочно фиксировался на бумаге и полностью не уносился током растворителя независимо от результата реакции антиген — антитело. В связи с этим метод реакции преципитации по типу нисходящей бумажной хроматографии не пригоден для определения видовой принадлежности крови в судебномедицинской экспертизе.

В 1961 г. В.Д. Савве и Г.С. Ушаков предложили вариант реакции преципитации по типу хроматографии на бумаге, чувствительность которого была выше обычной пробирочной реакции кольцепреципитации в 10—20 раз. Сущность метода в нанесении смеси антиген—антитело на хроматографическую бумагу: непрореагировавшие белки равномерно распределяются по бумаге, белковый комплекс преципитата остается у места введения смеси. С одной стороны специального штатива (см. рисунок) закрепляют вертикально лист хроматографической бумаги и под углом 90° к нему помещают в гнезда пипетки со смесями.

Установление видовой принадлежности крови реакцией преципитации с регистрацией на хроматографической бумаге.
Штатив для нанесения смесей на бумагу (вид сверху).

Мы выясняли возможность использования реакции преципитации Савве и Ушакова для установления видовой принадлежности крови в пятнах, а также определения чувствительности и специфичности этого метода. Смеси, состоящие из преципитирующих сывороток, вытяжек из пятен крови или разведений нормальных сывороток человека и животных в соотношении 1: 30—1: 50 (0, 5 мл антигена и 0, 010—0, 015 мл сыворотки), выдерживали час в термостате при 37°, переносили в пипетки, емкостью 1 мл, из которых с помощью специального штатива выпускали на хроматографическую бумагу, высушивали 5 мин. при 105°, окрашивали, погружая на 1 мин. в раствор 0, 05 г бромфенолового синего, 1 г сулемы, 2 мл ледяной уксусной кислоты в 100 мл дистиллированной воды, промывали струей водопроводной воды для удаления избытка красителя и высушивали. Реакцию считали положительной при наличии синего пятна или кольца в месте соприкосновения пипетки с бумагой. Применяли хроматографическую бумагу типа медленной Ленинградской фабрики им. Володарского. Для приготовления вытяжек и разведения сывороток пользовались физиологическим раствором.

В I серии опытов сравнивали чувствительность реакции, регистрируемой на бумаге, с реакцией преципитации в пробирках. В качестве антигенов использовали нормальные сыворотки свиньи, лошади, человека, коровы, кошки, собаки, курицы в разведениях 1:1000, 1:5000, 1:10 000, 1:20 000, 1:40 000, 1:60 000, вытяжки из пятен крови человека, свиньи, лошади, коровы, кошки, собаки, курицы (давностью от 2 месяцев до 1 года) в тех же разведениях и гомологичные сыворотки, преципитирующие белок свиньи серии 7 от 22/I 1963 г., белок лошади серии 101 от 26/XII 1962 г., человека серии 76 от 7/VII 1965 г., рогатого скота серии 30 от 2/IV 1965 г., собаки серии 1 от 7/VI 1963 г., кошки серии 76 от 8/VII 1964 г. и птицы серии 40 от 21/V 1963 г. Положительный результат реакции преципитации с регистрацией па хроматографической бумаге отмечался с разведениями антигенов от 1: 1000 до 1: 40000. В пробирочном варианте тот же результат был в разведениях от 1: 1000 до 1: 10 000 (см. таблицу).

Во II серии опытов сравнивали специфичность обеих реакций. В качестве антигенов использовали нормальные сыворотки лошади, коровы, человека, кошки, свиньи, собаки, курицы в разведении 1: 1000 и гетерологические сыворотки, преципитирующие белок лошади серии 101 от 26/XII 1962 г., серии 32 от 6/IV 1963 г., серии 93 от 27/XI 1962 г., белок свиньи серии 7 от 22/I 1963 г., серии 20 от 25/II 1963 г., серии 68 от 27/XI 1961 г., белок крупного рогатого скота серии 1 от 4/I 1963 г., серии 90 от 31/X 1962 г., серии 69 от 27/XI 1961 г., белок человека серии 76 от 7/VII 1965 г., серии 52 от 18/VI 1963 г., серии 51 от 4/I 1962 г., белок собаки серии 73 от 22/VI 1965 г., серии 47 от 4/VI 1963 г., серии 1 от 6/I 1962 г. Антигены с гетерологическими преципитирующими сыворотками дали во всех случаях отрицательный результат.

Результаты реакции в I серии опытов

В III серии опытов определяли минимальные количества навесок пятен крови различной давности, необходимые для постановки реакции преципитации с регистрацией на хроматографической бумаге. Исследовали пятна крови свиньи и лошади давностью 5 месяцев и пятна крови лошади и человека давностью 6 лет.

Навески пятен крови давностью 5 месяцев в 0, 3, 0, 5 и 1 мг и навески пятен крови давностью 6 лет в 1, 2, 5 мг заливали 15 мл физиологического раствора и экстрагировали 24 часа в холодильнике при температуре 5°. Гомологичные сыворотки, преципитирующие белок свиньи серии 7 от 22/I 1963 г., белок лошади серии 101 от 26/XII 1962 г., дали положительный результат с вытяжками из пятен крови давностью 5 месяцев с навеской пятна в 1 мг, а преципитирующая сыворотка на белок лошади серии 101 от 26/XII 1962 г. и преципитирующая сыворотка на белок человека серии 76 от 7/VII 1965 г. — с вытяжками из пятен крови давностью 6 лет с навесками 5 мг. Реакция кольцепреципитации дала отрицательный результат со всеми исследованными вытяжками.

Посуда для реакции должна быть абсолютно чистой. Перед заполнением пипеток или пробирок их ополаскивают физиологическим раствором.

Выводы

1. Реакция преципитации с регистрацией на хроматографической бумаге достаточно специфична. Она чувствительнее реакции кольцепреципитации примерно в 4 раза.
2. Метод позволяет устанавливать видовую принадлежность крови в небольших пятнах, когда реакция кольцепреципитации дает отрицательный результат.
3. Метод технически прост и нагляден. Результаты реакции можно прилагать к судебномедицинскому заключению.