Установление видовой принадлежности биологических объектов по IgG человека с помощью количественного твердофазного иммуноферментного анализа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

125284 Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13;

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ «БЮРО СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»

195067, Санкт-Петербург, Екатерининский пр., 10

УСТАНОВЛЕНИЕ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ ПО IgG ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

(Усовершенствованная медицинская технология)

Москва 2011

Аннотация

Предлагаемая медицинская технология «Установление видовой принадлежности биологических объектов по IgG человека с помощью количественного твердофазного иммуноферментного анализа» позволяет доказательно и наглядно устанавливать видовую принадлежность крови, выделений в следах и участках на вещественных доказательствах, а также фрагментов костей, либо других органов и тканей. Для исследования достаточна небольшая часть жидкого экстракта биологического материала - 20 мкл. Экстракт, необходимый для постановки реакции, может быть также изучен на наличие слюны, крови, пота, мочи, а сам материал сохраняется для исследования другими методами, в том числе, молекулярно-генетическими.

Усовершенствованная медицинская технология предназначена для использования врачами судебно-медицинскими экспертами биологических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы.

Разработчик/соразработчик: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский центр судебно-медицинской   экспертизы» Министерства здравоохранения и социального развития России; Санкт-Петербургское государственное учреждение здравоохранения «Бюро судебно-медицинской экспертизы»

Авторы: Эксперт СПб ГУЗ БСМЭ кандидат биологических наук В.Л. Сидоров; заведующий отделением судебно-биологических экспертиз ФГБУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития РФ, кандидат медицинских наук А.А. Гусаров; заведующая судебно-биологическая отделением СПб ГУЗ БСМЭ И.В. Исакова; заведующий кафедрой судебной медицины и правоведения Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, доктор медицинских наук, профессор О.Д. Ягмуров.

ВВЕДЕНИЕ

В зарубежных странах для установления видовой принадлежности крови и других биологических объектов по IgG достаточно широко используется метод иммуноферментного анализа (ИФА). Впервые его применили в Японии для установления видовой принадлежности крови (Таmaki Y. еt аl., 1984). Данная методика применяется для установления видовой принадлежности как крови (Tsutsumi Н. еt аl., 1987; Уаmamoto У. еt аl., 1989; Сапапео С, еt аl., 1992а), так и слюны (Fletcher S.М. еt аl., 1984), а также и костных фрагментов (Саttaneo С, еt аl., 1992, 19926,1999).

Нами был разработан усовершенствованный вариант указанного метода, с использованием отечественного тест-набора реагентов для иммуноферментного определения общего IgG (иммуноглобулина G) человека «IgG -общий-ИФА-БЕСТ». Данный тест-набор предназначен для определения IgG -общего (выделяют четыре изотипических подкласса IgG, кодируемых цифрами и обозначаемых как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Подклассы IgG различаются по способности связывать комплемент и активировать его по альтернативному пути, связываться с рецептором к Fe-фрагменту IgG на разных типах клеток и проникать через плаценту. С помощью указанного тест-набора можно измерить суммарно в сыворотке крови человека все подклассы IgG (IgG -общий).

Принцип метода заключается в том, что в результате количественного твердофазного ИФА образуется специфический иммунный комплекс с использованием иммобилизованных IgG - антител и моноклональных IgG -антител, меченых пероксидазой. Исследуемые IgG в результате анализа оказываются как бы «зажатыми» между молекулами иммобилизованных и меченых антител. Данный комплекс выявляется посредством окраски с помощью раствора тетраметилбензидина, после чего в лунки полистирольного планшета вносят стоп-реагент. Регистрация результатов реакции осуществляется фотометрически на регистрирующем приборе при длине волны 450 нм с введением результатов в компьютер.

Преимущества этого метода перед широко распространенными в настоящее время в судебно-медицинской практике методиками встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), реакцией кольцепреципитации (РКП) и реакцией иммунофлюоресценции (РИФ), применяемыми для установления видовой принадлежности биологических объектов, состоят в большей чувствительности по сравнению с ВИЭФ и РКП, а также в большей производительности и доказательности по сравнению с РИФ. Этим методом осуществляется объективный и количественный учет результатов с последующей компьютерной обработкой данных, что позволяет хранить их на жестком диске или других носителях, а также при необходимости распечатывать и иллюстрировать Заключение эксперта.

Показания к использованию медицинской технологии Методика   установления видовой принадлежности биологических объектов по  IgG  человека  с  помощью количественного твердофазного ИФА может быть использована при судебно-медицинском исследовании вещественных доказательств для установления видовой принадлежности обнаруженных на них следов крови, следов выделений, а также для установления видовой принадлежности фрагментов костей, частиц органов и тканей биологического происхождения.

Высокая чувствительность данной технологии по сравнению с традиционными методами и реакциями (РКП, ВИЭФ, РИФ), предназначенными для установления видовой принадлежности биологических объектов, определяет целесообразность её применения при исследовании замытых следов биологического происхождения и биологических следов с большим сроком давности образования.

Противопоказания к использованию медицинской технологии

Не выявлены.

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Набор реагентов для иммуноферментного определения общего IgG человека «IgG -общий-ИФА-БЕСТ» ЗАО «Вектор-Бест» по ТУ 9398-046-23548172-2006, используемый в клинической практике для диагностики уровня иммунитета человека по содержанию IgG -общ. в сыворотке крови.

Встряхиватель (шейкер от англ. chaik трясти) -термостатируемый серии SТ-3 фирмы «Елми Лтд» (Регистрационное удостоверение Минздрава РФ №96/636 от 04.09.1996г.).

Промыватель (вошер от англ. wash - мыть) медицинский микропланшетный «Со1umbus» фирмы «ТЕСАN Аustriа GmbH» (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/802 от 22.05.2003 г.).

Ридер (от англ, геаd - читать, считывать) - аппарат для фотометрического учета результатов реакции медицинский микропланшетный «Sunrise» фирмы «ТЕСАN Аustriа GmbH» с программным обеспечением «Маgellan» (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/829 от 22.05.2003 г.)

ОПИСАНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Пробоподготовка образцов

Вырезают фрагмент из объекта размерами 0,5x0,5 см, либо несколько вырезок из участка размерами 10x10 см, подозрительного на присутствие крови, либо выделений и контрольного участка предмета-носителя (в зависимости от тактики экспертного исследования, характера и величины следов), на котором требуется установить наличие крови (слюны, мочи, пота и т. п.). Исследуемый материал заливают минимальным необходимым (без избытка) объемом дистиллированной (лучше деионизированной) воды с Рh=7,2 -7,4 (соответствует РЬ сыворотки крови человека). Экстрагируют при температуре 4° С от 18 до 24 часов, после чего определяют наличие крови (выделений) в исследуемом материале. После установления наличия, определяют видовую принадлежность биологических объектов методом ИФА. При исследовании фрагментов костей, а также фрагментов органов и тканей биологического происхождения, исследуемый материал тщательно измельчают, не допуская его нагревания (вручную, без применения электромеханических орудий). Затем заливают минимальным необходимым (без избытка) объемом дистиллированной (лучше деионизированной) воды с Рh=7,2 -7,4. Экстрагируют при температуре 4° С от 48 часов (мышцы и другие мягкие ткани) до 5-7 суток (фрагменты костей). Экстракт тщательно перемешивают, после чего также определяют видовую принадлежность вышеуказанных биологических объектов методом ИФА.

В качестве положительного контроля можно использовать свежую сыворотку крови человека в разведении 1:100000 - 1:1000000. Остальные необходимые контроли (отрицательный контроль с содержанием IgG 0 нг/мл) и калибровочные пробы (образцы с различным содержанием IgG) имеются в тест-наборе.

Ход работы

Данный метод реализуется в следующей последовательности действий (рис. 1):

• - внесение в лунки полистирольного планшета по 100 мкл рабочего раствора для разведения сывороток (в нашем варианте постановки реакции мы разводим вышеуказанным раствором вытяжки);
• -  внесение в лунки полистирольного планшета по 20 мкл исследуемых, калибровочных и контрольных проб;
• -  инкубация в течение 30 минут на шейкере-термостате при температуре +37° С (интенсивность перемешивания 600-650 об/мин);
• -  промывание фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с Рh -7,2-7,4.  Из  имеющегося  в наборе концентрированного  ФСБ готовят рабочий раствор,  соответственно  инструкции на этикетке.  Либо  ФСБ готовят самостоятельно по следующей прописи (0,1 г КС1, 4 г. NаС1, 0,1 г. КН₂РО₄, 1,1 г. Nа₂НРО₄ х 7Н₂О  или  0,55 г  Nа₂НРO₄;  доливают  до 500  мл дистиллированной или деионизированной водой. К 500 мл ФСБ добавляют 0,25 мл детергента (Твин-20 или Тритон Х-100)). Приготовленным раствором доверху заполняют лунки планшета с помощью  вошера — автоматически,  либо  вручную,  затем полностью удаляют жидкость. Операцию повторяют 5 раз;
• -  внесение в лунки полистирольного планшета по 100 мкл рабочего раствора коньюгата (антител против IgG, меченых пероксидазой хрена);
• -  инкубация в течение 30 минут на шейкере-термостате при температуре +37° С (интенсивность перемешивания 600-650 об/мин);
• -  промывание фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с Рh -7,2-7,4;
• -  внесение в лунки полистирольного планшета по 100 мкл раствора тетраметилбензидина   (субстратный раствор тетраметилбензидина  (ТМБ)  представляет  собой  бесцветную жидкость на основе стабилизированного буферного раствора, содержащего 3,3^!,5,5^! - тетраметилбензидина гидрохлорида и перекиси водорода и полностью готов к использованию, не требует каких-либо добавок);
• - инкубация 10-15 минут при температуре + 37°С на шейкере-термостате (интенсивность перемешивания 400-500 об/мин), либо при комнатной температуре 15-30 минут;
• - внесение в лунки полистирольного планшета по 100 мкл стоп-реагента (1Н соляная кислота, входит в состав набора, готов к употреблению);
• -    регистрация результатов реакции фотометрически на ридере при длине волны 450 нм с введением результатов в компьютер;
• - распечатка результатов с помощью принтера.

Рис. 1. Схема проведения анализа

Оценка результатов

Компьютерную программу для ридера (программное обеспечение продается вместе с прибором, под каждый тест-набор пользователь сам или с помощью инженера-программиста составляет программу, исходя из инструкции к нему) следует написать так, чтобы отсечка (начало учета положительного результата) шла от минимальной положительной калибровочной пробы. Принцип калибровочного подсчета заключается в следующем: берется шесть прилагаемых к набору калибровочных проб - образцов с заведомо известной концентрацией IgG (например: 0 нг/мл; 1,4 нг/мл; 2,8 нг/мл; 6 нг/мл; 12 нг/мл, 24 нг/мл). Затем определяют в них оптическую плотность, после чего по шести точкам строят калибровочную кривую (это осуществляется на компьютере с помощью программного обеспечения) (рис. 2). Данная кривая служит основой для последующего определения концентрации IgG в исследуемых пробах, полученных с объектами на вещественных доказательствах.

концентрация IgG в нг/мл

Рис. 2. Калибровочная кривая тест набора, являющаяся основой для последующего определения концентрации IgG в исследуемых пробах, полученных с вещественных доказательств.

В приведенном примере калибровочной кривой, все, что больше или равно пробе с концентрацией 0,1 нг/мл по значению оптической плотности, должно отмечаться как (+), а все что меньше - как (-). Таким образом, если при исследовании вытяжки из исследуемого объекта получен положительный результат «+», то это свидетельствует о принадлежности данного объекта человеку.

Возможные осложнения при использовании медицинской технологии и способы их устранения

Не выявлены.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Технология апробирована на заведомых образцах крови, пота,  слюны,  человека,  высушенных на марле,  а также  на фрагментах трубчатых человеческих костей. Чувствительность реакции обнаружения IgG - разведение 1:10000000 и выше. По сравнению  с  традиционно  применяемыми  для  судебно-медицинского исследования методиками установления видовой принадлежности биологических объектов, обнаружение IgG методом твердофазного иммуноферментного анализа обладает рядом существенных преимуществ:

1. Высокая чувствительность и специфичность в сочетании с объективной регистрацией и возможностью компьютерной обработки результатов. Документирование результатов ИФА в табличной форме позволяет дополнительно иллюстрировать заключения экспертов.

2.  Высокая  технологичность  и  производительность метода.

В ходе проведения экспертных исследований данной методикой неоднократно были получены положительные результаты в пятнах, следах и участках на вещественных доказательствах, где реакцией встречного иммуноэлектрофореза видовую принадлежность биологических объектов установить не представилось возможным. Кроме того, удалось установить видовую принадлежность фрагментов мышечной ткани, подвергшихся сильным гнилостным изменениям.

3. Высокая  экономическая  эффективность  метода, связанная с меньшей стоимостью реагентов по сравнению со стоимостью преципитирующих сывороток, применяемых для установления видовой принадлежности   крови с помощью традиционных методов и реакций: РКП, ВИЭФ, РИФ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Tamaki Y., Kishida T., Nishimukai H. Identification of human blood with hybridoma-derived antibody to human immunoglobulin G // J. Forensic Sci. - 1984. - Vol. 29, N° 3. - P. 885-888.
2. Tsutsumi H., Htay H.H., Sato K., Katsumata Y. Antigenic properties of human and animal bloodstains studied by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using various antisera against specific plasma proteins // Z Rechtsmed. — 1987. — Vol. 99, 3. — P. 191-196.
3. Yamamoto Y., Tsutsumi A., Ishizu H. Species identification of blood and bloodstains by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-human immunoglobulin kappa light chain monoclonal antibody // Forensic Sci Int. - 1989. -Vol. 40, No l.-P. 85-95.
4. Cattaneo C., Gelsthorpe K., Phillips P., Sokol R.J. Detection of human proteins in buried blood using ELISA and monoclonal antibodies: towards the reliable species identification of blood stains on buried material // Forensic Sci Int. - 1992a. - Vol. 57, N° 2. - P. 139-146.
5. Fletcher S.M., Dolton P., Harris-Smith P.W. Species identification of blood and saliva stains by enzyme-linked immunoassay (ELISA) using monoclonal antibody // J. Forensic Sci. - 1984.-Vol. 29, N° l.-P. 67-74.
6. Cattaneo C., Gelsthorpe K., Phillips P., Sokol R.J. Reliable identification of human albumin in ancient bone using ELISA and monoclonal antibodies // Am J Phys Anthropol. - 1992. - Vol. 87, JMb 3. - P. 365-372.
7. Cattaneo C., DiMartino S., Scali S., Craig O.E., Grandi M., Sokol R.J. Determining the human origin of fragments of bum bone. A comparative study of histological, immunological and DNA techniques // Forensic Sci. Int. - 19926. - Vol. 102. - P. 181-191.
8. Cattaneo C., DiMartino S., Scali S., Craig O.E., Grandi M., Sokol R.J. Determining the human origin of fragments of burnt bone: a comparative study of histokogical, immunological and DNA techniques // Forensic Sci Int. - 1999. - Vol. 102, N° 2-3. - P. 181-191.