Особенности методики и техники исследования групповой дифференцировки крови человеческих плодов

Изучение развития изосерологических систем АВ0, MNSs, Р и резус в процессе эмбриогенеза¹ показало, что определение групповой дифференцировки крови человеческих плодов сопряжено с некоторыми особенностями методики и техники исследования, чрезвычайно важными для достижения правильных результатов.

Эти особенности связаны с тремя основными осложнениями: 1) затруднительностью получения крови из плодов раннего эмбрионального возраста и весьма малым ее количеством; 2) присутствием в крови аутоагглютинатов; 3) относительно более слабой, чем у взрослых, выраженностью групповых факторов.

Наилучшим способом извлечения крови из плода оказалось взятие ее из сердца, преимущественно из предсердий, и из крупных кровеносных сосудов (аорта, верхняя полая вена). В другую пробирку мы собирали также и ту кровь, которая изливалась в грудную полость.

При отсутствии крови в сердце прибегали к отделению головы плода и путем легкого массирования передней поверхности тела выдавливали кровь из перерезанных сосудов шеи.

Если и этот прием не давал положительных результатов, использовали поверхностные кровоизлияния, которые часто наблюдались у плодов в случаях самопроизвольных выкидышей. Отдельные мелкие кусочки мягких тканей с кровоизлияниями помещали в пробирку с минимальным количеством физиологического раствора и взбалтывали, а кусочки тканей удаляли. При этом образовывалась взвесь эритроцитов, необходимая для исследования.

Особенно много усилий требовало устранение аутоагглютинатов, которые содержатся в крови, извлекаемой из плодов. В крови из сердца аутоагглютинаты в единичных случаях отсутствовали или имелись в незначительном количестве; много агглютинатов обычно было в крови, полученной из грудной полости.

Эти аутоагглютинаты визуально несколько отличаются от специфических агглютинатов: они более компактны и не имеют гроздьевидной формы.

К объяснению наличия аутоагглютинатов в крови плодов можно привлечь (разумеется, лишь в качестве рабочей гипотезы) соображения, которые высказали Фланаган и Митома (Flanagan, Mitoma) в отношении причин ложной агглютинации, происходящей при исследовании цельной крови плодов с примесью вартонова студня из пуповины.

Эти авторы считают, что действующим началом в вартоновом студне является гиалуроновая кислота, которая в присутствии белка типа альбумина или в соединении с ним вызывает неспецифическую агглютинацию эритроцитов. Такого рода агглютинация быстро устраняется добавлением энзима — гиалуронидазы. Как известно, гиалуроновая кислота (кислый мукополисахарид) представляет собой один из главных компонентов так называемого основного вещества соединительной ткани и играет роль цементирующего агента, как бы склеивающего отдельные тканевые элементы и клетки. Она имеет большое значение в проницаемости тканей и в процессах регенерации их. Гиалуронидаза — это группа ферментов, вызывающих гидролитическое расщепление гиалуроновой кислоты. Гиалуронидаза играет существенную роль в изменении проницаемости тканей; помимо того, содержась в сперматозоидах, она расщепляет гиалуроновую кислоту в оболочках яйцеклетки и тем самым способствует оплодотворению. Можно предположить, что гиалуроновая кислота в организме плода (особенно в ранний период внутриутробной жизни) бывает связана с тканевыми элементами в меньшей степени, чем во взрослом организме, и потому имеет возможность более широко проявлять свое действие, в том числе и на кровь. Это предположение может перейти в уверенность только на основании соответствующих экспериментов.

Поскольку мы не располагали гиалуронидазой, пришлось обратиться к другому способу освобождения крови от аутоагглютинатов — многократному отмыванию эритроцитов физиологическим раствором при чередовании кратковременного и продолжительного центрифугирования взвеси с длительным ее отстаиванием. Таким путем удавалось добиться полного устранения указанных агглютинатов.

Выявление групповых факторов изосерологической системы АВ0 в крови плодов обеспечивалось следующим: 1) применением всех стандартных гемагглютинирующих сывороток с возможно более высоким титром; 2) использованием наряду с изосыворотками бета и альфа иммунных сывороток анти-В и анти-А; 3) употреблением экстракта из семян растения Cytisus sessilifolius, содержащего фитагглютинин (лектин) анти-Н с титром 1:256 для обнаружения агглютиногенов 0 и Н в тех случаях, когда эти агглютиногены не открывались иммунной сывороткой анти-О(Н), имеющий титр 1:16; 4) длительным (20—30 минут) центрифугированием смеси сывороток и эритроцитов в процессе определения агглютиногенов и агглютининов пробирочным методом.

Что касается обнаружения агглютиногенов М, N и Р, то основным условием получения достоверных результатов являлось исследование эритроцитов крови плода несколькими сериями каждой сыворотки — анти-М, анти-N и анти-Р.

Для дифференцирования резусположительной и резусотрицательной крови тоже обязательно применяли несколько серий человеческой сыворотки анти-D или анти-D + С. Поскольку эти сыворотки содержали неполные Rh-антитела-агглютиноиды наряду с теми или иными антителами изосерологической системы АВ0, пользовались, во-первых, методом конглютинации, а, во-вторых, сообразовались с тем, к какой группе — А, В или АВ относилась кровь плода. Например, если его кровь принадлежала к группе А, то употребляли антирезусную сыворотку групп АВ или А и т. д.

Реакцию конглютинации осуществляли в желатиновой среде по способу Фиска и Макги. Оказалось, что хотя этот способ очень прост и эффективен, его все же нельзя рекомендовать для исследования крови плодов. Малое количество крови, извлекаемое из них, обычно не позволяет выделить порцию крови для взятия на оксалат; с отмытыми же эритроцитами и с неотмытой эритроцитной массой реакция Фиска и Макги дает худшие результаты, чем с оксалатной кровью. Поэтому мы нашли более целесообразным пользоваться непрямой пробой Кумбса, которую применяли также и в тех случаях, когда метод Фиска и Макги приводил к отрицательным данным при исследовании крови родителей.

С целью выявления слабо выраженных агглютиногенов и агглютининов результаты всех реакций — агглютинации, конглютинации и непрямой пробы Кумбса — учитывали не только невооруженным глазом и с лупой, но и под микроскопом. В связи с этим при исследовании агглютиногенов А, В, 0, М и N иммунными стандартными сыворотками реакцию агглютинации проводили не на матовой плоскости (фарфоровые тарелки), а на предметных стеклах. Для рассматривания препаратов невооруженным глазом и с лупой под стекла подкладывали белую бумагу.

Пренебрежение особенностями крови плодов может привести к серьезным ошибкам в определении групповой дифференцировки с соответствующими последствиями в области теоретических обобщений.

Ярким примером этого служат исследования Ф. Зандера (F. Sander) и его соавторов — М. Зандер, Крейцбурга и др. (М. Sander, Creuzburg, 1949—1955). Они утверждали, что у всех плодов до 3-месячного возраста в крови совместно присутствуют агглютиногены А, В, М и N. По мере развития плода групповая дифференцировка изменяется, но все же частота группы АВ бывает в 10 раз больше, а отсутствие агглютиногенов А и В встречается в 2 раза реже, чем у взрослых. В крови плодов 5,5—7 месяцев группа АВ наблюдается уже в 36% случаев и только в связи с группой MN. Ко времени рождения распределение групп становится таким же, как у взрослых. Ф. Зандер и др. не проводили систематического определения групп крови родителей и только в некоторых случаях исследовали кровь матери, реже — отца. В их материале 8 раз имелось следующее сочетание групп: кровь плода относилась к группе АВ, а кровь одного из родителей — к группе 0 (7 матерей и один отец), чего вообще не бывает.

Повышенную частоту группы АВ у плодов отметили также Фуджитака (Fujitaka, 1929—1930), Ито (Ito, 1932) и Л.С. Волкова (1960).

Мы имеем основания полагать, что более частое обнаружение группы АВ у плодов может зависеть от двух причин: 1) погрешностей в методике и технике исследования; 2) повышенного числа самопроизвольных абортов при гетероспецифической беременности.

Ф. Зандер и его соавторы для объяснения указанного явления прибегли к построению ряда необоснованных теорий: о существовании особых фетальных рецепторов; о первоначальной закладке всех факторов — А, В, М и N с последующей элиминацией излишних; о динамико-серогенетической антропологии. Таким образом, отвергалось одно из основных представлений о наследовании групповых факторов, а именно, что у потомства не возникают агглютиногены, отсутствующие у обоих родителей. Эти взгляды не нашли поддержки. В 1952 г. Кра и Вильдхаген (Kjah, Wieldhagen), например, указали, что причиной ошибок Ф. Зандера и др. явилось нарушение действующей в ГДР официальной инструкции о необходимости отмывать эритроциты плодов перед определением групповой принадлежности. Применяя цельную кровь и принимая аутоагглютинацию и неспецифическую агглютинацию за специфичную, Ф. Зандер и др. пришли к неверным выводам. Соглашаясь с мнением Кра и Вильдхагена, мы на основании своих экспериментов считаем, что в данном случае ошибочность результатов исследований заключалась главным образом в том, что не учитывалось существование в крови плодов аутоагглютинатов. Если бы перед определением групп плодов Ф. Зандер и его соавторы соблюдали обязательное для всех научных изысканий правило — предварительное установление особенностей исходного материала и произвели микроскопическое исследование крови без добавления стандартных сывороток, они были бы избавлены от необходимости создавать вышеуказанные «теории».

Подобные факты в отношении исследования крови детей и их родителей имеют место и в отечественной литературе. Так, Т.Г. Соловьева и Н.И. Пасункова (Ленинградский институт переливания крови, 1955), пользуясь дефектной техникой определения групп изосерологических систем АВ0 и MN, нашли отклонения от порядка наследования групповых признаков, установленного многочисленными исследованиями во всем мире, в том числе и в СССР.Т. С. Барташевич (Белорусский институт переливания крови, 1957), обследовав 509 семей, состоявших из 1984 человек (из них 966 детей), обнаружила 5 исключений из известного порядка наследования групповых факторов. Автор не обратил внимания на то, что все эти «отклонения» зависели от групповой принадлежности отца, а не матери. Не подумав о том, что отцовство могло быть спорным, Т.С. Барташевич сделала вывод, что групповые признаки А, В и 0 могут встречаться у детей при любом сочетании агглютиногенов в крови родителей.

Таким образом, неудовлетворительная методика определения групповой принадлежности, равно как и непродуманная оценка получаемых результатов, еще до последних лет продолжает нарушать закономерное развитие учения о групповой дифференцировке человеческого организма и связанных с ним познаний о наследственности у человека.

Выводы

1. Для извлечения крови из плодов раннего эмбрионального возраста можно пользоваться различными путями, выбирая наиболее подходящий в каждом конкретном случае.
2. При исследовании изосерологических систем в крови человеческих плодов необходимо учитывать наличие в ней аутоагглютинатов и более слабую, чем у взрослых, выраженность групповых факторов.
3. Эти особенности крови плодов требуют соответствующих изменений методики и техники исследования.
4. Вышеуказанные положения имеют существенное значение для судебномедицинской экспертизы при разрешении вопроса о принадлежности плода определенным родителям.

¹ Судебномедицинская экспертиза, 1962, № 1.