К вопросу приготовления гетероиммунных гемагглютинирующих сывороток анти-Le^a и анти-Le^b

За последнее время открыто много новых факторов крови, не входящих в систему АВ0, MN и Rh. Для выявления этих факторов в жидкой крови и в ее следах на вещественных доказательствах необходимы специальные сыворотки, которых у нас пока нет, за исключением сывороток анти-Р, полученных М.В. Мишаковой в Институте судебной медицины.

В 1946 г. Морант (Mourant) в сыворотке одной женщины обнаружил неизвестный агглютинин, не связанный с известными группами крови, и назвал его анти-Le^a, по фамилии этой женщины. В 1948 г. Андрезену (Andresen) удалось выявить еще одно новое антитело — анти-Le^b. Антитела системы Льюис (Lewis) находятся в крови людей как естественные холодовые неполные или полные агглютинины. Они могут быть также иммунными неполными и вызывать посттрансфузионные осложнения. Причем агглютинины анти-Le^a встречаются чаще, чем анти-Le^b.

Еще в 1939 г. Фурухата (Furuhata) и Уеяма (Ueyama) обнаружили в сыворотках кур преципитины анти-Т, идентичные с анти-Le^a.

Система крови Льюис сложная: она состоит из агглютиногенов Le (а+в—), Le (а—в+ ) и Le (а—в—).

Агглютиногены системы Льюис обнаружены Груббом (Grubb) и Морантом (Mourant) в эритроцитах, сыворотке и плазме, а также в слизистых клетках кишечника, слюнной железы и в почечных клетках. Кроме того, их находили в слюне, желудочном соке, молоке и жидкости овариальной кисты. В семенной жидкости они не выявлены [Шеффлер (Scheffler)].

По химическому составу Грубб, Морант и др. считают Le(a+) и Le(b+)-агглютиногены очень схожими. Они являются растворимыми в воде термостабильными мукоидами. Исследования И. Снис (I. Sheath) и П. Снис (Р. Sheath) показали, что антигены системы Льюис являются плазматическими, фиксирующимися на эритроцитах. При инкубации эритроцитов Le(a+B—) или Le(a—b+) в плазме, лишенной этих антигенов, они отдают свой антиген ей и, наоборот, если в плазме имеются недостающие в эритроцитах антигены Le(a+) или Le(b+), эритроциты приобретают это свойство. При отмывании эритроцитов в физиологическом растворе они теряют его.

Грубб указал на тесную связь системы Льюис с «выделительством» АВН субстанций. Все лица, имеющие в крови фактор Le(a+), являются «невыделителями», а лица с фактором Le(b+) — «выделителями». Среди лиц Le(a—b—) имеются как «выделители», так и «невыделители». Le(a+) «выделителей» до сих пор не обнаружено. По данным Грубба Брендемена и Моргана (Morgan), в слюне у «невыделителей» агглютиногенов изосерологической системы АВ0 содержится агглютиноген Le(a+), а у «выделителей» — агглютиноген Le(a+) и Le(b+). В слюне лиц, относящихся к группе Le(a—b—), либо не имеется льюиссубстанций, либо обнаруживается одна из них, а иногда и обе (в редких случаях).

Установленная связь между системой «выделительства» и системой Льюис имеет большое значение для судебной медицины. Разрешение вопроса о спорном отцовстве с помощью этой системы представляет трудности. По Андрезену, этот агглютиноген появляется у детей лишь в течение первого года жизни. Сначала появляется агглютиноген Le(a+), а затем — Le(b+). У детей до 6-месячного возраста автор находил агглютиноген Le(a+) в 70%, у годовалых — в 29%, а к 18 месяцам — в 18—26%, как и у взрослых.

Ввиду того что, по данным опубликованной литературы и наших исследований, человеческие сыворотки с наличием изо- или изоиммунных агглютининов анти-Le^a и анти-Le^b обладают низкими титрами, а для исследования крови в судебномедицинских целях и при переливании крови необходимы сыворотки более высокого титра, мы попытались получить их путем иммунизации животных.

Для приготовления сывороток анти-Le^a кроликов внутривенно иммунизировали эритроцитами группы 0 Le(a+b—). От иммунизации кроликов эритроцитами человека нам не удалось получить специфичной сыворотки анти-Le^a, хотя Акира от иммунизированных кровью кроликов получил одну не вполне специфичную сыворотку анти-Le^a. Следующую партию кроликов мы иммунизировали кровью и слюной «невыделителей» группы 0 Le(a+b—), считая, что при таком методе иммунизации образуется меньше групповых агглютининов к системе АВ0 и что эти агглютинины будут легче удаляться при абсорбции сывороток. Но и этот метод иммунизации не дал положительных результатов, как и иммунизация кроликов 10% раствором гуммиарабика [Озаки (Ozaki) иммунизировал кроликов смолой разных деревьев, в том числе и смолой гуммиарабика, в результате чего получил агглютинирующие сыворотки анти-Le^a с неполными антителами].

Поскольку зарубежными авторами описано изготовление сывороток анти-Le^a с неполными антителами в результате иммунизации слюной кроликов (Исеки и др. ) и с полными антителами при иммунизации коз [Керде (Kerde), Прокоп (Prokop) и др. ], мы пытались получить сыворотки анти-Le^a иммунизацией кроликов слюной «невыделителей» группы О Le(a+b—). Учитывая, что у этой категории лиц в слюне содержится только агглютиноген Le(a+), мы надеялись, что в процессе иммунизации кролики в основном будут продуцировать антитела анти-Le^a.

Пятнадцати кроликам в течение 6 дней ежедневно вводили в вену по 5 мл кипяченой слюны. На 9-й день брали пробу крови. Сыворотки абсорбировали параллельно эритроцитами Le(a—b+) как обработанными, так и не обработанными трипсином. После абсорбции эритроцитами, не подвергшимися обработке трипсином, нам не удалось приготовить ни одной специфичной сыворотки, тогда как после абсорбции трипсинизированными эритроцитами было получено 7 специфичных сывороток анти-Le^a с неполными антителами. Титр этих сывороток при реакции с трипсинизированными эритроцитами Le(a+) колебался от 1:8 до 1:128; с нетрипсинизированными эритроцитами сыворотки оказались неактивными, за исключением одной, которая давала положительную (+) реакцию в разведении 1:8. Следовательно, последняя наряду с неполным антителом обладала полным агглютинином невысокого титра.

Не довольствуясь полученными результатами, мы попытались получить сыворотку анти-Le^a с полными антителами более высокого титра путем иммунизации козы, которой 7 раз через каждые 3 дня внутривенно вводили кипяченую слюну группы 0 Le(a+b—), причем первый раз ввели 6 мл, остальные — по 10 мл. Ввиду того что последние 3 инъекции коза плохо переносила, за час перед внутривенным введением вводили внутримышечно 2 мл слюны, а затем остальные 8 мл. На 9-й день после последней инъекции взяли пробу крови. Полученную сыворотку, так же как и кроличью, абсорбировали параллельно эритроцитами группы Le(a—b+), трипсинизированными и не обработанными трипсином. После абсорбции первыми получена сыворотка с неполными антителами с титром 1:32, после абсорбции вторыми — с полными антителами с титром 1:8. Получив сыворотки анти-Le^a с полными и неполными агглютининами, мы приступили к иммунизации животных для получения сывороток анти-Le^b.

Из опубликованных данных [Брендемен, Симмонс и Миллер (Brendemoen, Simmons, Miller)] известно, что сыворотки анти-Le^b часто агглютинируют эритроциты Le(b—) группы А₂ и 0, потому что в этих сыворотках агглютининам анти-Le^b часто сопутствуют и антитела анти-О. Накаима, Фуито и Ямада (Nakaima, Fuito, Jamada) обнаружили в сыворотке человека холодовые агглютинины анти-Le^b. Эта сыворотка вступала в реакцию с некоторыми эритроцитами Le(b—). При ее абсорбции эритроцитами Le(b+) агглютинин сохранился. Сыворотки анти-Le(b+) значительно лучше выявляют агглютиноген Le(b+) в эритроцитах группы 0 и А₂, слабее или вовсе не определяют его в эритроцитах группы А₁ Считают, что агглютиноген А₁ как бы препятствует развитию Le(b+) [Деланей (Delaney)]. Существуют сыворотки анти-Le^b двух родов: анти-Le^bН, которые вступают в реакцию со слюной всех АВН «выделителей» и ведут себя, как сыворотки анти-Н, и анти-Le^bL, соединяющиеся со слюной АВН «невыделителей». Из опубликованных источников известно, что попытки получения иммунных сывороток путем иммунизации кроликов эритроцитами человека группы Le(b+) не увенчались успехом (Штейнкопф (Steinkopf) ]. Также не удалось получить сыворотки анти-Le^b иммунизацией коз слюной «выделителей» [Керде, Фюнфхаузен (Funfhausen), Прокоп и др.]. Изеки, Мазаки (Masaki) и Шибазаки (Shibasaki) в результате иммунизации кроликов слюной «выделителей» 0 Le(a—b+) получили сыворотки анти-Le^b с неполными холодовыми антителами, активными с трипсинизированными эритроцитами. Титр этих сывороток колебался от 1:4 до 1:8, а с эритроцитами группы А был очень низок.

Для получения сывороток анти-Le^b кроликов иммунизировали внутривенным введением эритроцитов 0 Le(b+). Ни в одном из этих случаев нам не удалось получить сыворотки анти-Le^b, так же как и от иммунизированных эритроцитами и слюной «выделителей» 0 Le(b+).

Следующую партию (25 кроликов) мы иммунизировали слюной «выделителей» ежедневно в течение 6 дней, вводя им в вену по 5 мл кипяченой слюны группы 0 (Le(a—b+). На 9-й день после последней инъекции взяли пробу крови. Полученные иммунные сыворотки подвергли абсорбции трипсинизированными эритроцитами группы Le(a+b—), в результате чего были получены 2 сыворотки анти-Le^b, активные с эритроцитами Le(b+), группы 0 или А₂, обработанными трипсином; с эритроцитами же групп А₁, В и АВ сыворотки были неактивны. Такие сыворотки не могли нас удовлетворить. В связи с этим полученные от иммунизации этих кроликов сыворотки мы стали абсорбировать эритроцитами Le(b+) с целью изготовить сыворотки анти-Le^a, учитывая, что слюна «выделителей» содержит наряду с агглютиногеном Le(b+) также и агглютиноген Le(a+); следовательно, в сыворотках возможно было ожидать и наличие антител анти-Le^a. В результате такой абсорбции были приготовлены 2 сыворотки анти-Le^a с неполными антителами и с титром 1:8.

Стремясь получить сыворотки анти-Le^b, активные с эритроцитами всех групп изосерологической системы АВ0, мы приступили к иммунизации козы слюной выделителя» 0 Le(a—b+). Было проведено 9 инъекций слюны по 10 мл внутривенно 2 раза в неделю. Последние 2 инъекции сопровождались плохим самочувствием козы. На 9-е сутки после последнего введения слюны взяли пробу крови. Сыворотку абсорбировали эритроцитами Le(a+), обработанными и не обработанными трипсином. В результате абсорбции первой получена сыворотка анти-Le^b с неполными антителами с титрами 1:128 [с эритроцитами 0 Le(b+)] и 1:64 [с эритроцитами В Le(b+). Наиболее низкий титр был с эритроцитами группы A Le(b+). После абсорбции этой сыворотки эритроцитами Le(a+), не обработанными трипсином, получена сыворотка анти-Le^b, содержащая полные агглютинины и активная при комнатной температуре с эритроцитами группы Le(b+) в солевой реакции. Титр этой сыворотки с эритроцитами 0 Le(b+) — 1:32, с А2 Le(b+) — 1:16, с В Le(b+) — 1:16 и с эритроцитами A₁ — 1:8.

Таким образом, от иммунизации козы получены 2 сыворотки анти-Le^b: одна с полными, а другая с неполными агглютининами.

Для выявления агглютиногенов Le(a+) и Le(b+) в эритроцитах реакцию агглютинации проводили пробирочным методом. К 2 каплям сыворотки добавляли одну каплю 2% взвеси трипсинизированных или нетрипсинизированных эритроцитов и оставляли при комнатной температуре на 1 —1,5 часа. Затем пробирки с содержимым центрифугировали в течение 1 минуты при 1000 об/мин и встряхивали. За результатом реакции наблюдали невооруженным глазом и под микроскопом.

Для определения оптимальных температурных условий действия этих сывороток реакцию проводили с одними и теми же образцами крови при разных температурных режимах. Активность сывороток оказалась одинаковой как при низкой (4—6°), так и при комнатной (18—28°) температуре. Несколько слабее реакция протекала при 37°.

В связи с тем что по опубликованным данным, изо- и изоиммунные сыворотки системы Льюис очень нестойки и сохраняют свои свойства на холоде до 2 месяцев, а при комнатной температуре — лишь несколько дней, интересно было проследить устойчивость иммунных сывороток анти-Le^a и анти-Le^b при пребывании их в разных температурных условиях. Хранение сывороток анти-Le^a (12 серий) в рефрижераторе при 4—6° показало, что через 6 месяцев титр двух из них снизился; спустя год наблюдалось ослабление титра еще одной сыворотки; титр остальных остался на первоначальном уровне. Часть жидких сывороток (5 серий) хранили при комнатной температуре в темноте. По истечении 6 месяцев титр двух из них снизился вдвое, а к концу года без изменения остался исходный титр лишь одной сыворотки. Сыворотки анти-Le^a (9 серий) были подвергнуты лиофильному высушиванию и в дальнейшем хранились в рефрижераторе. Высота титра сухих сывороток при 4—6° не претерпела изменений в течение года, за исключением сыворотки одной серии, титр которой снизился. Специфичность как. жидких, так и сухих сывороток анти-Le^a при указанных условиях хранения оставалась без изменений в пределах года. Что касается сывороток анти-Le^b, то сохранение их свойств при разных температурных условиях изучалось лишь 3 месяца, в течение которых как при комнатной температуре, так и при низкой высота титра и специфичность сыворотки остались без изменения.

Таким образом, наилучшим условием сохранения свойств сывороток системы Льюис является их высушивание, а наименее благоприятным — хранение в жидком состоянии при комнатной температуре. Изучение сохраняемости сывороток анти-Le^b при различных температурных режимах будет продолжаться.

Полученными сыворотками анти-Le^a исследована кровь 700 доноров. В 101 образце выявлен агглютиноген Le(a+), что составляет 14,4%. Распределение этого агглютиногена в зависимости от групп изосерологической системы АВ0 представлено в таблице.

В имеющейся в нашем распоряжении литературе мы не нашли указаний о распределении групп системы Льюис у населения Советского Союза. По данным Андрезена и др., группа Le(a+) встречается у 18—26% европейцев.

Кроме того, нашими сыворотками было проведено определение агглютиногенов Le(a+) и Le(b+) в крови 235 доноров, в результате чего Le(a+) выявлен у 32 человек, что составляет 13,7%; Le(b+) -у 179, или у 76, 1%; Le(a—b—) — у 24 человек, или у 10,2%.

Кроме того, было поставлено несколько опытов с целью определения агглютиногенов системы Льюис в образцах сухой крови на марле и в корочках. Результаты оказались обнадеживающими.

Выводы

Получены гетероиммунные гемагглютинирующие сыворотки анти-Le^a и анти-Le^b с полными и неполными антителами.

Эти сыворотки являются активными в условиях низкой и комнатной температуры.

При хранении в рефрижераторе как сухие, так и жидкие сыворотки сохраняют свои свойства.

Эти сыворотки выявляют агглютиногены системы Льюис в жидкой крови.

От редакции

Гетероиммунные козьи сыворотки анти-Le^a и анти-Le^b применялись в отделе судебномедицинского исследования вещественных доказательств Института судебной медицины в процессе научной и экспертной работы при исследовании жидкой и высохшей крови; качество этих сывороток, особенно анти-Le^a, оказалось хорошим.