Одновременное совместное установление наличия и видовой принадлежности человеческой спермы

Несмотря на интенсивную работу судебных медиков по изысканию наиболее целесообразных методов установления семенного происхождения пятен, диагностика до сих пор базируется в основном на результатах морфологического исследования — выявлении сперматозоидов. При азооспермии или разрушении сперматозоидов доказательство наличия спермы в пятнах становится невозможным. Отсюда понятно стремление найти способ, позволяющий диагностировать сперму в пятнах при отрицательном исходе морфологического исследования.

Наше внимание привлекли эксперименты Reimann, Prokop и Scheele (1962) в отношении дифференцирования женского и коровьего молока при помощи экстракта из клубней картофеля.

Исходя из этих данных, мы решили испытать действие сока из клубней картофеля с различными выделениями человеческого организма. Картофельный сок агглютинировал человеческие эритроциты групп 0, А, В и АВ. Предварительные опыты показали, что эта агглютинация задерживается женским молоком и спермой. Другие выделения (слюна, пот, моча, вагинальный секрет, выделения из носа), а также кровь и гной такого действия не оказывали. Наиболее отчетливые результаты получены с эритроцитами группы 0.

Опыты проводили следующим образом. Клубень картофеля тщательно промывали водой и физиологическим раствором, очищали от кожуры, ополаскивали физиологическим раствором и натирали на мелкой терке. Полученную массу помещали на стерильную марлю, отжимали сок, фильтровали его через стерильный бумажный фильтр и разводили в 50 раз физиологическим раствором. К капле исследуемого материала (жидкий объект или вытяжка из пятна) в агглютинационной пробирке добавляли каплю картофельного сока и каплю 1% взвеси однократно отмытых эритроцитов группы 0, смесь центрифугировали 10 мин. при 3000 об/мин. и энергично встряхивали в штативе. Задержку агглютинации учитывали последовательно невооруженным глазом, с лупой и микроскопически (на предметных стеклах под покровными).

За положительный результат принимали полное отсутствие агглютинации при микроскопическом исследовании, за отрицательный — наличие агглютинации. В случае отрицательного исхода реакции агглютинация почти всегда была отчетливо видима невооруженным глазом, причем часто все эритроциты оказывались соединенными в один компактный крупный конгломерат.

Прежде чем приступить к основным экспериментам исследовали сок клубней картофеля 53 разных сортов. Среди них имелись старые и новые сорта, распространенные по всей территории СССР или растущие только в определенных районах.

Соком из клубней каждого сорта испытывали как женское молоко и сперму, так и другие указанные выше объекты, включив в их число сперму животных (быка, барана, хряка). В процессе опытов выяснилось, что сок из клубней различных сортов обладает неодинаковой активностью. Это существенно сказывается на исходе реакции задержки агглютинации. Если&­ активность сока чрезмерно высока, то степень задержки агглютинации спермой и женским молоком снижается, что нарушает отчетливость результатов реакции; иногда задержка вообще не обнаруживается. Когда активность сока низка, агглютинацию задерживают не только сперма и женское молоко, но и другие выделения, кровь и гной, причем в зависимости от сорта картофеля задержку агглютинации вызывают избирательно различные объекты исследования. Установлено, что оптимальным титром картофельного сока для дифференцирования спермы и женского молока от прочих испытанных биологических объектов является 1:32.

В связи с этим сок, имеющий высокую активность (например, из клубней сортов «Варба», «Голландский» и «Лорх»), обеспечивал специфичный исход реакции при разведении 1:150. Сок клубней многих сортов картофеля требовал меньшего разведения — 1:50, некоторых сортов — 1:40. Из отдельных сортов получен малоактивный сок, проявляющий надлежащее действие при разведении 1:5 («Катюша», «Бородянский») или 1:3 («Любимец»), И лишь сок клубней картофеля сорта «Элла» оказался совсем неактивным.

Отсюда следует, что при реакции очень важно учитывать сорт картофеля, титровать получаемый сок и разводить его до оптимального титра.

Для титрования сок разводят физиологическим раствором в геометрической прогрессии. К капле сока в каждом разведении добавляют каплю 1% взвеси однократно отмытых эритроцитов группы 0. Смеси центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин. (число оборотов может быть и меньшим) и встряхивают в штативе. Показатель титра определяют наибольшим разведением, с которым различают агглютинацию при микроскопическом исследовании. Разведение экстракта до титра 1:32 проводят так же, как и разведение сывороток.

Для основных опытов избрали картофель сорта «Приекульский ранний», широко распространенный по всей стране, сок из клубней которого, будучи разведен в соотношении 1:50, имел титр 1:32 при установлении его эритроцитами группы 0.

Прежде всего двумя путями выясняли чувствительность реакции задержки агглютинации.

1. Навески по 1 мг марли, интенсивно пропитанной спермой, и такие же навески из контрольных участков марли экстрагировали физиологическим раствором при 4° в течение 20—22 часов (меньший срок, как показали опыты, недостаточен). Физиологический раствор добавляли с таким расчетом, чтобы он полностью пропитал материал и остался в незначительном избытке. Вытяжки исследовали, как указано выше. Для контроля всегда исследовали сок в рабочем разведении, добавляя к капле сока каплю 1% взвеси однократно отмытых эритроцитов группы 0. Пятна спермы имели давность 4—5 дней. Таким образом исследовали сперму 103 человек, один из которых страдал олигоспермией, а 17 — азооспермией. Во всех случаях получен положительный результат — полная задержка агглютинации.
2. Участки пятен, содержащие 5 мг высохшей спермы (это устанавливали путем взвешивания равных по площади кусочков марли со спермой и без нее), экстрагировали таким же способом. Вытяжку из каждого пятна разводили в 5, 10, 50, 100, 500, 1000 и 5000 раз и во всех перечисленных разведениях проводили реакцию задержки агглютинации. Исследовали те же пятна спермы 103 человек. Способность спермы разных мужчин задерживать агглютинацию оказалась неодинаковой, но всегда достаточно хорошо выраженной (см. таблицу).

Задержка агглютинации вытяжками из пятен спермы

Установлено, что чувствительность реакции достаточно высока.

Далее определяли пределы специфичности реакции. С этой целью исследовали нормальную сыворотку человеческой крови в жидком состоянии и вытяжки из пятен (на марле, давностью 4 дня) вагинального секрета, мочи, пота, слюны, выделений из носа, периферической и менструальной крови, гноя, женского и коровьего молока, спермы быка, барана и хряка. В опыт вводили возможно большие навески объектов (120—380 мг),

Изготовление вытяжек и проведение реакции задержки агглютинации были такими же, как и при определении чувствительности реакции.

Задержка агглютинации произошла только с вытяжками из пятна женского молока, причем положительный результат наблюдали с очень небольшой навеской (1 мг). Во всех остальных случаях получен отрицательный результат: отсутствие задержки или незначительное ослабление агглютинации отдельными объектами.

Следовательно, реакцию можно признать практически специфичной для спермы при условии дополнительного дифференцирования пятен спермы и женского молока.

Дифференцировать эти пятна очень просто. Каплю вытяжки, приготовленной для исследования соком картофеля, помещали на предметное стекло и добавляли каплю метилового спирта. Затем из жидкости делали тонкий мазок, который высушивали при комнатной температуре. Мазок (уже фиксированный метиловым спиртом) окрашивали в течение 20 мин. суданом III (1 часть ацетона + 1 часть 70° этилового спирта + порошкообразная краска до получения перенасыщенного раствора), промывали 1 мин. 50° этиловым спиртом и исследовали под микроскопом. Если пятно образовалось от женского молока, в мазке обнаруживали много красновато-оранжевых капель жира. В мазке из пятна спермы их не было.

Большой интерес представляет то обстоятельство, что сперма животных (быка, барана и хряка) и коровье молоко не задерживают агглютинацию человеческих эритроцитов, вызываемую картофельным соком.

Таким образом, данная реакция не только особенно характерна для некоторых биологических объектов, но и отличается видовой специфичностью, так как дает положительный результат лишь с человеческой спермой и женским молоком.

Нужно полагать, что действующим началом картофельного сока является особый фитагглютинин, природа которого остается пока неясной. Не имеется и определенных данных о веществе, которое может задерживать агглютинацию, вызываемую различными растительными экстрактами.

Действующее начало картофельного сока довольно термостабильно — не инактивируется в течение 30 мин. при 85° (водяная баня). При тех же условиях не инактивируется и реагирующее с картофельным соком вещество, содержащееся в человеческой сперме и женском молоке.

Для выяснения постоянства задержки агглютинации спермой исследовали пятна (на марле), хранившиеся в темноте при комнатной температуре до 11,5 месяцев.

Провели 3 серии опытов.

В I серии пятна спермы 23 человек из числа образцов, которые использовали для определения чувствительности реакции, исследовали через 1 месяц — 2 месяца 20 дней после изготовления. Подобрали образцы, задерживающие реакцию агглютинации в различной степени (наиболее слабо, умеренно и наиболее сильно); среди них имелись образцы спермы лиц, страдающих олигоспермией и азооспермией. Методика экспериментов была той же, что и при установлении чувствительности реакции. Испытывали вытяжки из навесок пятен по 1 мг и вытяжки из участков пятен, содержащих 5 мг высохшей спермы, разведенные в 5, 10, 50, 100, 500, 1000 и 5000 раз. Получены такие же данные, как и в опытах со свежими пятнами (давность 4—5 дней).

Во II серин опытов пятна спермы 124 человек, ранее не исследованные, испытывали после хранения их в течение 3 месяцев — 6 месяцев 20 дней. Применяли ту же методику. Вытяжки из навесок пятен по 1 мг во всех случаях вызывали задержку агглютинации. Результаты, полученные в опытах с вытяжками из пятен в различных разведениях, почти не отличались от результатов исследований пятен 4-дневной давности.

В III серии опытов пятна спермы 56 человек из числа тех, которые исследовали во II серии экспериментов, испытывали через 6 месяцев 9 дней— 11,5 месяцев после изготовления. Методика была та же. Получены такие же результаты, как и при хранении этих пятен в течение 3 месяцев—6 месяцев 20 дней.

Вещество спермы, реагирующее с соком картофеля, оказалось очень устойчивым, что обеспечивает постоянство реакции.

Специальные эксперименты проводили для выяснения вопроса о том, не препятствует ли задержке агглютинации спермой примесь вагинального секрета, крови и гноя.

К 10 каплям крови добавляли 5 капель жидкой спермы. После тщательного смешивания жидкость выливали на марлю и высушивали при комнатной температуре. На высушенные пятна вагинального секрета, взятого у 10 женщин, 9 из которых страдали кольпитом, а 1 — хроническим уретритом, наносили по 0, 003 мл спермы. На высушенные пятна гноя, полученного у 10 человек (при парапроктите, гангрене, мастите, флегмоне, карбункулах и язве ноги неизвестного происхождения), наносили то же количество спермы. Участки пятен, на которые наносили сперму, обшивали ниткой. Через 4 дня проводили исследование двумя способами, примененными для определения чувствительности реакции, причем в опыт постоянно включали пятна той же спермы без каких бы то ни было примесей. Установлено, что присутствие в следах спермы примеси крови, вагинального секрета и гноя не нарушает результатов реакции задержки агглютинации.

Учитывая специфику судебномедицинского материала, необходимо было проследить, не оказывают ли неблагоприятного воздействия на течение и исход указанной реакции загрязненные предметы-носители (различные материалы вещественных доказательств). С этой целью исследовали неразведенные вытяжки из 42 бывших в употреблении загрязненных материалов: по 6 образцов хлопчатобумажной, капроновой и шелковой трикотажной ткани, по 4 образца шерстяной материи и драпа, по 3 образца сатина и штапеля, по 2 образца кожи, овчины, ткани из искусственного шелка и репса, по 1 образцу лайки и ткани из натурального шелка (навески перечисленных материалов 133—500 мг). Задержка агглютинации ни разу не наблюдалась. Кроме того, на 6 очень загрязненных предметов-носителей (лоскуты от пиджака, верхней мужской рубашки, 2 пар брюк, кепи, кусочки ваты из стеганных брюк) наносили по 1 мл семенной жидкости. Через 4 дня проводили исследование. Загрязненные материалы не препятствовали задержке агглютинации спермой.

Реакция с картофельным соком была применена в одной экспертизе, проведенной в Институте судебной медицины. На части мужской рубашки из белой хлопчатобумажной ткани имелись пятна желтоватого цвета, лишь в 2 из них обнаружены сперматозоиды. В опыт были включены 2 пятна, семенное происхождение которых являлось доказанным, 3 пятна, в которых сперма не выявлена, и соответствующие контрольные участки ткани. Навески испытуемых объектов были равны 1 мг. Задержка агглютинации наблюдалась только с вытяжками из 2 пятен спермы; с вытяжками из остальных пятен и контрольных участков ее не произошло.

Данный случай особенно интересен потому, что убедительно подтверждает достаточно высокую чувствительность, практическую специфичность и постоянство предлагаемой нами реакции, а также независимость ее исхода от расположения следов спермы на загрязненном предмете. Несмотря на сочетание неблагоприятных обстоятельств — значительная давность образования пятен (не менее 1 года) и чрезвычайная загрязненность вещественного доказательства, — наличие человеческой спермы установлено именно в тех пятнах, где были выявлены сперматозоиды, а отрицательный результат получен с теми следами, в которых сперматозоиды не обнаружены, причем успех реакции был обеспечен малым количеством объектов исследования (навески по 1 мг).

Из изложенного следует, что реакция с картофельным соком очень доступна и легко осуществима.

Нельзя, конечно, считать, что все вопросы, касающиеся указанной реакции, уже полностью разрешены. Весьма существенно, что она позволяет выяснять семенное происхождение пятна даже при разрушении сперматозоидов и азооспермии, чего невозможно сделать при морфологическом исследовании. Однако еще нет достаточных оснований для суждения о том, явится ли эта реакция доказательной для наличия человеческой спермы или лишь пополнит число предварительных (ориентировочных) методов. К определенному мнению в этом отношении позволит прийти только накопление обширного материала.

Остается пока неизвестным, как отражается на действии картофельного сока длительное хранение клубней, так как основные эксперименты проведены на картофеле, незадолго перед этим вырытым из земли. Правда, отдельные предварительные наблюдения показывают, что действующее начало сока не исчезает и при продолжительном хранении клубней.

Выводы

1. Применение сока из клубней картофеля позволяет в процессе одной весьма простой реакции определять наличие и видовую принадлежность некоторых биологических объектов.
2. Картофельный сок агглютинирует эритроциты человека вне зависимости от их групповой принадлежности, однако эта агглютинация в сильной степени задерживается женским молоком и человеческой спермой. Коровье молоко и сперма животных такого эффекта не оказывают.
3. Действующее начало сока из клубней картофеля различных сортов обладает неодинаковой активностью; оно термостабильно и, по-видимому, является особым фитагглютинином, природа которого пока неясна. Реагирующее с картофельным соком вещество спермы и молока очень устойчиво и тоже термостабильно.
4. Для реакции следует пользоваться соком картофеля, разведенным физиологическим раствором до титра 1:32, и применять 1% взвесь однократно отмытых эритроцитов группы 0.
5. Положительным результатом нужно считать отсутствие агглютинации (полная задержка) даже при микроскопическом исследовании.
6. Разработанный вариант реакции можно использовать для одновременного совместного определения наличия и видовой принадлежности человеческой спермы в пятнах, так как он практически специфичен, достаточно чувствителен и постоянен, а пятна спермы легко дифференцируются от пятен молока реакцией на жир.
7. Длительный срок, прошедший с момента образования следов спермы (до 11,5 месяцев в нашем материале), примесь к сперме вагинального секрета, крови и гноя, а также расположение пятен спермы на различных загрязненных материалах вещественных доказательств не нарушают течение и исход реакции с картофельным соком.
8. Пока еще нет оснований судить о том, явится ли эта реакция доказательной для наличия человеческой спермы или лишь пополнит число предварительных (ориентировочных) методов, но она выгодно отличается от морфологического исследования, так как дает положительный результат в случаях разрушения сперматозоидов и азооспермии. Для решения вопроса о степени доказательности реакции требуется накопление обширного материала.