Сравнительное изучение гетероиммунных гемагглютинирующих сывороток анти-А, полученных разными методами иммунизации и абсорбции

В поисках путей повышения авидитета иммунных гемагглютинирующих сывороток анти-А и анти-В мы изучали влияние различных факторов на это их свойство. В результате ранее проведенных исследований (1959) выяснили, что лучшей продукции антител и более высокому их титру способствует выбор антигена (крови) для иммунизации и абсорбции с хорошей агглютинабельностью и абсорбционной способностью и взятие крови для иммунизации от многих доноров. Авидитет указанных сывороток не зависит от качества абсорбента; он не изменяется ни при длительном их хранении, ни при ревакцинации кроликов.

Таблица 1

Эритроциты для иммунизации

№ до­но­ра	Агглю­тина­бель­ность эритро­ци­тов	Групповая принадлежность (по системам)
		АВ0 MN	Р	Lae	Lbe	Kell	Fya	Lu	s
1	1:1024	AN	+—	—	—	—	—	—	—
2	1:1024	AMN	+	—	+	—	+	—	—
3	1: 512	AMN	+++	—	+++	—		—

Обозначения: — отсутствует, +— выражена слабо, + удовлетворительно, +++ сильно абсорбционная способность 7 ступеней.

В данной работе мы выясняли значение методов иммунизации кроликов и абсорбции сывороток, а также роль групповой (помимо системы АВ0) характеристики примененного для иммунизации антигена.

Проведено 4 серии опытов на 40 кроликах, 20 из которых иммунизировали ежедневно в течение 12 дней — по Dunsford и Bowly 50% взвесью трижды отмытых эритроцитов группы А в физиологическом растворе. Контрольные 20 кроликов иммунизировались 30% взвесью эритроцитов группы А по следующей схеме: 1-ю неделю в понедельник, вторник и среду вводили в вену по 1 мл взвеси, 2—4-ю неделю в понедельник — 2 мл в брюшину, а во вторник и среду — по 1 мл в вену.

Иммунизацию опытных и контрольных кроликов проводили одновременно кровью одних и тех же доноров; животные были одного веса и возраста. В каждую серию опытов входило 5 опытных и 5 контрольных кроликов. В первых III сериях животных иммунизировали изученной кровью 1 из 3 доноров, в IV серии — смесью крови этих 3 доноров. Предварительно исследовали ее агглютинабельность и абсорбционную способность. Кровь брали с наименьшим количеством групповых антигенов (донор № 1), с большим количеством хорошо выраженных групповых факторов (донор № 3); среднее положение занимал донор № 2 (табл. 1).

Через 7 дней после иммунизации пробно исследовали сыворотку каждого кролика. Сыворотки абсорбировали 2 методами: многократно (метод, применяемый в нашем институте) и однократно по Dunsford и Bowly. Сыворотки инактивировали 30 мин. в водяной бане при 56°. При многократной абсорбции их разводили в 16 раз и в количестве 2 мл от каждого кролика абсорбировали 30 мин. при комнатной температуре половинным объемом трижды отмытых эритроцитов BMN.

Титр и специфичность сывороток проверяли на тарелках с однократно отмытыми стандартными эритроцитами групп А и В, последующие абсорбции производили в течение 60 мин. меньшими дозами эритроцитов (1/4, 1/8 и т. д. объема сыворотки).

Положительной считали пробу при титре сывороток не ниже 1:32 и специфичности не менее 5 мин. Для пробного исследования однократной абсорбцией сыворотки разводили 1:30, 1:60 и 1:120, 2 мл каждого разведения абсорбировали таким же объемом соответствующих эритроцитов 5 часов при 4—6°. Учет производили на плоскости и в пробирках, для чего сыворотку титровали в 3 рядах агглютинационных пробирок до разведения 1:1024 так, чтобы в каждой пробирке содержалось 2 капли разведенной сыворотки, куда добавляли по 1 капле 2% взвеси эритроцитов: в первый ряд пробирок — группы А, во второй — В и в третий — 0. Пробирки оставляли на 30 мин. при комнатной температуре, центрифугировали в течение 2 мин., учет производили с помощью лупы и под микроскопом.

Число кроликов с положительным результатом как при иммунизации кровью доноров с различной групповой принадлежностью, так и разными методами иммунизации было примерно одинаковым (табл. 2), однако иммунизация смешанной кровью от 3 доноров имеет некоторое преимущество: 4 из 10 кроликов выработали антитела достаточного титра.

Таблица 2

Результат иммунизации 40 кроликов

№ доно­ра, кото­рому при­над­ле­жат анти­ген­эритро­циты	Число кроли­ков, вырабо­тав­ших анти­тела анти-А
	4-недель­ным ме­тодом	12-кратн­ым ме­то­дом
1	1	1
2	1	2
3	1	1
1, 2, 3 (смешаны)	2	2

Таблица 3

Значение разницы титров у неабсорбированных сывороток

№ кро­ли­ка	Титр сыво­ро­ток до абсорб­ции с эритро­цитами			Резуль­тат
	А	В	0
800	1:2048	1:2048	1:2048	—
801	1:8192	1:512	1:2048	+
802	1:8192	1:8192	1:8192	—
803	1:8192	1:8192	1:4096	—
804	1:8192	1:8192	1:8192	—
805	1:4096	1:4096	1:4096	—
806	1:16 384	1:16 384	1:16 384	—
807	1:4096	1:2048	1:4096	—
808	1:16 384	1:1024	1:2048	+
809	1:32 728	1:8192	1:16 384	+

Обозначения: + специфическая сыворотка получена; — не получена.

До абсорбции исследовали титр специфических и неспецифических антител сывороток иммунизированных кроликов.

Эти исследования, как и предыдущие, показали, что высокий титр неабсорбированной сыворотки еще не гарантирует высоту титра после абсорбции. Чем больше была разница в титре специфических и неспецифических антител, тем выше был титр абсорбированных сывороток. Следовательно, по разнице титра указанных антител неабсорбированной сыворотки можно заранее знать, сыворотку каких кроликов следует абсорбировать (табл. 3).

После пробного исследования гетероиммунных сывороток изготовили специфичные сыворотки для дальнейшего изучения. Для абсорбции брали кровь группы BMN. Одной и той же серией сыворотки анти-В проверяли агглютинабельность и абсорбционную способность крови 20 доноров. Было отобрано 4 образца крови, 2 из которых обладали высокими агглютинабельностью и абсорбционной способностью, а 2 — более низкими. Большой разницы в агглютинабельности образцов крови группы В не обнаружено (табл. 4).

Таблица 4

Кровь доноров для абсорбции

№	Агглю­тина­бель­ность	Число ступе­ней погло­ще­ния
1	1:128	5
2	1:128	6
3	1:256	6
4	1:512	7

Таблица 5

Титр сывороток анти-А в зависимости от качества абсорбента и метода абсорбции

№	№ кро­ли­ка	Абсорб­ция абсорбен­том № 2		Абсорб­ция абсор­бен­том № 4
		одно­крат­ная	много­крат­ная	одно­крат­ная	много­крат­ная
		титр
1	801	1: 32	1: 512	1: 64	1: 512
2	808	1: 64	1: 256	1: 128	1: 512
3	809	1: 32	1: 1024	1: 128	1: 1024
4	810	1: 64	1: 1024	1: 128	1: 256
5	824	1: 32	1: 256	1: 32	1: 256
6	832	1: 32	1: 256	1: 32	1: 512
7	833	1: 64	1: 256	1: 64	1: 1024
8	841	1: 128	1: 1024	1: 128	1: 1024
9	845	1: 16	1: 256	1: 128	1: 512
10	850	1: 128	1: 128	1: 256	1: 512
11	851	1: 128	1: 512	1: 32	1: 1024

Таблица 6

Агглютинабельность и абсорбционная способность сухой крови

Груп­па	Агглю­ти­набель­ность	Чис­ло сту­пе­ней погло­ще­ния
АП	1: 128	5
	1: 128	5
	1: 512	7
	1: 1024	7
	1: 1024	7
Bill	1: 128	6
	1: 128	6

Так же как и при пробном исследовании, опытные сыворотки готовили 2 способами абсорбции. При многократной абсорбции нативные инактивированные сыворотки разводили в 12 раз, 10 мл каждой сыворотки абсорбировали половинным объемом эритроцитов одного из отобранных доноров. После проверки титра и специфичности продолжали абсорбировать, как описано выше, до получения специфичных сывороток. Одновременно абсорбировали (этим же абсорбентом) методом однократной абсорбции, предварительно подобрав соответствующее разведение, при котором однократная абсорбция могла быть достаточной для изготовления специфичной сыворотки.

Было изготовлено многократной и однократной абсорбцией эритроцитами донора № 1 по 8, доноров № 2 и 4 по 11 и донора № 3 по 5 специфичных сывороток анти-А, а всего — по 35 сывороток каждым методом абсорбции. Титр сывороток, полученных методом многократной абсорбции, оказался гораздо выше, чем при однократной. Имела также значение хорошая агглютинабельность и абсорбционная способность абсорбента (табл. 5).

Все полученные сыворотки проверяли в реакции абсорбции агглютининов для выяснения зависимости авидитета сыворотки от антигена, абсорбента и метода иммунизации и абсорбции. Реакцию абсорбции агглютининов ставили с 7 образцами сухой крови, агглютинабельность и абсорбционная способность указаны в табл. 6.

Способ абсорбции (однократной или многократной) влияет на высоту титра полученных сывороток анти-А, но не на их авидитет (табл. 7).

Нет существенной разницы и в авидитете сывороток, абсорбированных кровью одного и того же донора, но полученных в результате иммунизации кровью доноров с разной групповой характеристикой в отношении антигенного состава крови. У кроликов, иммунизированных смесью крови 3 доноров, титр специфичных сывороток был несколько выше. Такие же результаты получены и при абсорбции кровью других доноров (табл. 8).

Таблица 8

Титр и авидитет сывороток в зависимости от антигена (абсорбент № 4)

№ анти­гена	№ кро­ли­ка	Титр	Сту­пе­ни по­гло­ще­ния
1	801	1: 512	5—7
	810	1: 256	5—7
2	808	1: 512	6—7
	809	1: 1024	6—7
	845	1: 512	6—7
3	824	1: 256	5—7
	841	1: 64	5—7
1, 2, 3	832	1: 512	5—6
	833	1: 1024	5—6
	850	1: 512	6
	851	1: 1024	5—7

Таблица 7

Авидитет сывороток анти-А в зависимости от метода абсорбции

Сыво­рот­ка кро­ли­ка №	Абсорб­ция абсор­бен­том № 2		Абсорб­ция абсор­бен­том № 4
	одно­крат­ная	много­крат­ная	одно­крат­ная	много­крат­ная
	ступе­ни по­гло­ще­ния
801	4—6	4—6	5-7	5—7
808	5—7	5—6	5—7	5—7
809	6—7	6—7	6—7	6—7
810	5—7	6—7	5—7	5—7
824	6—7	6—7	5—7	5—7
832	6—7	6—7	5—7	5—6
833	6—7	6—7	5—7	5—6
841	6—7	6—7	6—7	6—7
845	—	5—6	6—7	6—7
850	6—7	6—7	5—7	6
851	5—7	5—7	5—7	5—7

Выводы

1. Разные методы иммунизации кроликов, различный антигенный состав (с небольшим и наибольшим количеством групповых антигенов) примененной для этого крови не влияют на высоту титра и авидитет продуцируемых антител анти-А.
2. Титр сывороток, полученных от многократной абсорбции малыми объемами крови, гораздо выше, чем при однократной абсорбции большим количеством крови.
3. Абсорбция кровью с хорошей агглютинабельностью дает более высокий титр сывороток.
4. По разнице в высоте титра специфических и неспецифических антител иммунных сывороток анти-А можно судить о возможности изготовления из них специфичных сывороток.