Сравнительная оценка методов изолирования аминазина из трупного материала

Вопросу изолирования, обнаружения и определения аминазина и его метаболитов в объектах биологического происхождения посвящено большое число отечественных и зарубежных работ. Токсикология, метаболизм и методы изолирования, обнаружения и определения неизмененных производных фенотиазина (аминазина и др. ) и их метаболитов в жидкостях и тканях человека и животных рассмотрены нами в предыдущих сообщениях.¹

Основным методом изолирования и определения аминазина (ларгактила, хлорпромазина и др. ) в 5—10 г органов, 20 мл мочи и 5 мл крови человека и животных до настоящего времени является метод Дюбо и Паскаля, основанный на экстракции основания аминазина эфиром из щелочной среды, последующей реэкстракции в 0, 1 н. растворе серной кислоты и количественном определении по реакции с концентрированной серной кислотой. Для определения общего количества аминазина в крови (свободная и связанная формы) авторы применили кислотный гидролиз, достигаемый при нагревании с соляной кислотой (удельный вес 1, 19), а для анализа мочи — щелочной гидролиз, проводимый при нагревании в течение 2 часов с 20% раствором карбоната натрия при 100°.

Curry описал видоизмененный метод Дюбо и Паскаля для изолирования и определения производных фенотиазина в крови и ткани печени. Навеску печени мацерируют 10 мл воды и 13, 5 мл соляной кислоты, а навеску крови обрабатывают 2 мл воды и 8 мл соляной кислоты. Смесь нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин., охлаждают льдом, отделяют кислотный слой и смешивают с 12 мл 60% раствора едкого кали. Охлажденный щелочной раствор двукратно (по 50 мл) извлекают эфиром. Эмульсию расслаивают центрифугированием, эфирные извлечения отделяют, объединяют и встряхивают с 10 мл 2,5% раствора едкого натра, затем с 10 и 5 мл воды и реэкстрагируют 5 мл 0, 1 н. раствора серной кислоты. Сернокислый слой отделяют и после улетучивания следов эфира снимают ультрафиолетовый спектр в диапазоне волн от 220 до 320 ммк. Производные фенотиазина имеют максимум абсорбции при 255 ммк. Метаболиты аминазина в форме сульфоксидов могут давать максимум абсорбции при 240, 275 и 300 ммк. С реактивом FPN ² производные фенотиазина и их метаболиты образуют красное, пурпурное, голубое или зеленое окрашивание.

Clarke отметил, что производные фенотиазина можно изолировать из внутренних органов методом Стас—Отто. Этим методом В.С. Гольденберг и Я.З. Лемберский изолировали аминазин и дипразин из внутренних органов человека. При этом аминазин открывали в, хлороформном извлечении из аммиачной среды, а дипразин — в извлечениях из кислой и аммиачной среды, но лучше из последней.

Л.И. Ушакова для изолирования аминазина из трупного материала применяла экстракцию ацетоном из тканей, предварительно измельченных и растертых с безводным сульфатом натрия (1:3). После упаривания ацетона остаток обрабатывали водой, водную фазу отфильтровывали и дважды извлекали новыми порциями эфира, затем водный слой подщелачивали раствором аммиака и трижды извлекали хлороформом. Аминазин обнаруживали в остатках после упаривания хлороформного извлечения из аммиачного раствора. Аминазин из крови (5 г) экстрагировали по методу Дюбо и Паскаля.

Для обнаружения аминазина (в остатках после упаривания аммиачно-хлороформных извлечений) применяли следующие методы: 1) реакции с общеалкалоидными осадочными реактивами — Майера, Зонненштейна и Драгендорфа; 2) реакции окрашивания с концентрированными серной, азотной кислотами, реактивами Марки, Фреде, бромной водой, раствором хлорного железа, концентрированной серной кислотой и нитритом натрия, концентрированной соляной кислотой и нитратом натрия; 3) инфракрасную спектроскопию.

Аминазин при исследовании крови по методу Дюбо и Паскаля определяли визуально (стандартные шкалы).

Рассмотренные методы изолирования аминазина из трупного материала в основном охарактеризованы для определения аминазина в незначительных навесках, и поэтому во многих случаях они не могут быть использованы при судебно-химических исследованиях. Описанные методы изолирования из 100 г навесок органов применяли без установления оптимальных условий извлечения и экстракции аминазина, без изучения границ обнаружения и определения, специфичности реакций обнаружения и т.д. Таким образом, разработка оптимального метода изолирования и обнаружения аминазина представляет практический интерес.

Экспериментальная часть

Нами было показано, что аминазин не экстрагируется эфиром из кислой среды (pH 2, 0—3, 0 по универсальному индикатору), а экстрагируется им в форме основания только из щелочной среды, наиболее полно при pH 13, 0 (при подщелачивании 50—60% раствором едкого натра). Использование хлороформа, дихлорэтана и других галогенопроизводных для экстракции приводит к образованию стойких эмульсий, потерям при экстракции и исключает реэкстракцию аминазина в сернокислую фазу (что необходимо для очистки и количественного определения).

Для разработки наиболее рационального метода изолирования из трупного материала мы подвергли сравнительному изучению 4 наиболее часто применяемых метода изолирования и экстракции органических соединений: методы Дюбо и Паскаля, Васильевой, Крамаренко и Стас—Отто.

Изолирование по методу Дюбо и Паскаля. Мелкоизмельченные 100 г печени, содержащие определенное количество аминазина, через 2 суток заливали 100 мл дистиллированной воды и 135 мл концентрированной соляной кислоты, смешивали и нагревали на кипящей водяной бане 5 мин. при постоянном помешивании, затем охлаждали льдом и фильтровали. К солянокислому извлечению добавляли 120 мл предварительно промытого эфиром 60% раствора едкого натра. Охлажденный раствор (pH 12, 0—13, 0) трижды извлекали новыми порциями (по 100 мл) эфира. Эмульсию центрифугировали и эфирный слой отделяли. Объединенные эфирные извлечения встряхивали с 30 мл 2,5% раствора едкого натра, отмывали 30 и 15 мл дистиллированной воды и реэкстрагировали 0, 1 н. раствором серной кислоты. Сернокислотный слой отделяли и после улетучивания следов эфира объем доводили в мерной колбе до 50 мл 0, 1 н. раствором серной кислоты. Количество аминазина определяли по методу Дюбо и Паскаля в модификации Л.И. Гребенника с использованием фотоэлектроколориметра ФЭКН-57 [кювета 5,105, светофильтр №4 (ЛЯМБДА=508 ммк), эталон сравнения — контроль реактивов]. Результаты опытов приведены в табл. 1. (В первых 5 опытах подщелачивание солянокислого извлечения производили 60% раствором едкого натра до pH 12, 0—13, 0, в последующих — 20% раствором карбоната натрия до pH 9,0—10,0).

Таблица 1

Изолирование по методу Дюбо и Паскаля

Максимальное количество аминазина экстрагируется из растворов, обработанных 60% раствором едкого натра до pH 13, 0. Но при этом извлекают не более 7% аминазина, содержащегося в исследуемой навеске печени. При подщелачивании солянокислых растворов карбонатом натрия до pH 9, 0—10, 0 аминазин извлекают только в пределах 3—4,5%. Метод Дюбо и Паскаля не может быть рекомендован для использования в экспертной практике.

Изолирование по методу Васильевой. Мелкоизмельченные 100 г печени заливали 200 мл дистиллированной воды (к печени было заранее добавлено определенное количество аминазина — в пересчете на основание), подкисляли 10% раствором щавелевой кислоты до pH 2,0—3,0. Через 2 часа кислое водное извлечение отфильтровывали в делительную воронку, органы и фильтр промывали небольшим количеством подкисленной воды (pH 2,0—3,0). Промывные воды присоединяли к основному извлечению, двукратно экстрагировали эфиром, затем подщелачивали 25% раствором аммиака до pH 9, 0—10, 0 и трижды экстрагировали равными порциями эфира (общий объем эфира равнялся объему водной фазы). Эфирные извлечения объединяли и упаривали в чашке при температуре 30—40°. Маслянистый остаток растворяли в 10 мл 0,1 н. раствора серной kислоты и через 30 мин. проводили количественное определение выделенного аминазина по методике, приведенной выше. Одновременно проводили изолирование тем же методом, но подщелачивали водное извлечение 60% раствором едкого натра до pH 13, 0. Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Изолирование по методу Васильевой

Как видно из табл. 2, аминазин экстрагируется в пределах 3—7%, но при использовании в качестве щелочного агента едкого натра удается извлечь до 16% аминазина, т.е. в, 2—5 раз больше. Чтобы выяснить влияние кислоты на полноту изолирования из внутренних органов по методу Васильевой, водное извлечение подкисляли 25% раствором серной кислоты до pH 2, 0—3, 0. Результаты приведены в табл. 3.

Таким образом, изолирование из трупного материала по методу Васильевой происходит более полно при подкислении водного извлечения 25% раствором серной кислоты до pH 2,0—3,0 и последующей экстракции аминазина в форме основания из щелочной среды при pH 13, 0; при извлечении из трупного материала для подкисления водного извлечения следует применять не 10% раствор щавелевой кислоты, а 25% раствор серной кислоты, так как при этом извлекается до 30% аминазина.

Таблица 3

Влияние кислоты на извлечение по методу Васильевой

Изолирование по методу Крамаренко. Мелко. измельченные 100 г печени заливали 0,02 н. раствором серной кислоты в количестве, обеспечивающем создание зеркала ее толщиной не менее 0,5 см, перемешивали и с помощью универсального индикатора устанавливали pH 2,0—3,0. Смесь периодически перемешивали в течение 2 часов, процеживали через марлю и еще дважды извлекали в течение 1 часа новыми порциями 0,02 н. раствора серной кислоты.

Кислые извлечения объединяли и центрифугировали, надосадочные жидкости сливали, осадок заливали 0,02 н. раствором серной кислоты (pH 2,0—3,0), перемешивали, настаивали в течение 1 часа, вновь центрифугировали и присоединяли жидкость к первоначальному извлечению. Объединенные извлечения насыщали сульфатом аммония и оставляли на 2 часа. Выделившийся осадок отделяли центрифугированием, жидкость отфильтровывали, pH ее доводили до 2, 0—3, 0 и дважды (порциями по 50 мл) извлекали эфиром. К кислой водной вытяжке осторожно добавляли 20% раствор едкого натра до pH 9, 0—10, 0 и трижды экстрагировали хлороформом. Для каждой экстракции брали объем хлороформа, равный 1/3 объема водной фазы. Хлороформные вытяжки соединяли, фильтровали и упаривали на водяной бане при 30—40°. Маслянистый остаток после упаривания растворяли в 10 мл 0,1 н. раствора серной кислоты и через 30 мин. производили количественное определение по методике, приведенной выше. Результаты опытов приведены в табл. 4. Затем проводили аналогичное извлечение из трупного материала, но сернокислое извлечение подщелачивали не 20%, а 60% раствором едкого натра до pH 13,0, а основание аминазина экстрагировали не хлороформом, а эфиром (также троекратно).

Как видно из табл. 4, метод Крамаренко дает самый низкий выход аминазина и поэтому непригоден для изолирования аминазина из трупного материала. По-видимому, значительное количество аминазина сорбируется сульфатом аммония и белковыми веществами кислого водного извлечения.

Изолирование по методу Стас — Отто. Мелкоизмельченные 100 г печени трижды (объемами по 200 мл) извлекали 96° спиртом при pH 2, 0—3, 0 (подкисляли 10% раствором щавелевой кислоты). Каждый раз через сутки спиртовые извлечения отфильтровывали. Объединенные спиртовые извлечения упаривали на водяной бане (при 60°) до густоты сиропа. Белковые вещества 3 раза осаждали 96° или абсолютным спиртом. Остаток после упаривания обрабатывали 50 мл дистиллированной воды (40°), раствор количественно отфильтровывали в делительную воронку. Кислую водную фазу (pH 2, 0— 3, 0) дважды (объемами по 20 мл) экстрагировали эфиром, извлечения отфильтровывали, объединяли и упаривали при 40°. Кислую водную фазу подщелачивали 25% раствором аммиака до pH 9, 0—10, 0 или 60% раствором едкого натра до pH 13, 0 и извлекали эфиром (4 раза по 20 мл). В опытах, результаты которых представлены в табл. 5, аммиачные эфирные извлечения отфильтровывали, упаривали при 40°, маслянистый остаток растворяли в 10 мл 0, 1 н. раствора серной кислоты и после получасового настаивания определяли аминазин; щелочные эфирные извлечения соединяли и дробно реэкстрагировали 0,5 н. раствором серной кислоты (10, 10, 10, 10 и 5 мл), каждый раз по 5 мин. После улетучивания следов эфира из сернокислого реэкстракта объем его доводили до 50 мл с помощью 0,5 н. раствора серной кислоты и определяли выделенный аминазин по методике, приведенной выше.

Из результатов проведенных опытов (см. табл. 1—5) следует, что наиболее рациональным является метод Стас — Отто с внесенными нами изменениями — подкислением спиртового извлечения до pH 2, 0—3, 0 спиртовым раствором (10%) щавелевой кислоты, а экстракция аминазина в форме основания при pH 13, 0 с последующей реэкстракцией: в 0,5 н. растворе серной кислоты.

Границы обнаружения и определения аминазина предложенным нами методом представлены в табл. 6.

Таблица 4

Изолирование по методу Крамаренко

Таблица 5

Изолирование по методу Стас—Отто

Таблица 6

Границы обнаружения аминазина в трупном материале модифицированным методом Стас—Отто

Граница обнаружения составляет 0,2 мг, граница определения — 0,5 мг.

Выводы

1. Проверено и охарактеризовано 4 метода изолирования аминазина из трупного материала.
2. Разработан метод изолирования, обнаружения и определения аминазина в трупном материале. Граница обнаружения составляет 0,2 мг, граница определения — 0,5 мг основания аминазина в 100 г трупного материала. Метод позволяет выделять до 52,5% добавленного к. органам аминазина.

¹ Аптечное дело, 1965, № 4; Судебно-медицинская экспертиза, 1966, № 1.

² Для приготовления реактива смешивают 45 частей 20% раствора хлорной кислоты, 50 частей 50% раствора азотной кислоты и 5 частей 5% раствора хлорида окисного железа.