Реакция преципитации в агаре как метод дифференцирования белков филогенетически близких животных (Сообщение 2)

В предыдущем сообщении¹ было показано, что сравнительная реакция преципитации в агаре является простым и объективным методом, позволяющим различать белки филогенетически близких видов животных. В частности, удалось дифференцировать пятна крови крупного и мелкого рогатого скота, а также различных видов домашних птиц при помощи обычных (поливалентных) преципитирующих сывороток.

Целью настоящей работы явилось выяснение возможности использования других модификаций реакции преципитации в агаре для дифференцирования белков животных, близких в филогенетическом отношении.

В иммунологии для выяснения сходства и различия антигенных комплексов большое распространение получила реакция торможения преципитации в агаре (Г.И. Абелев с соавторами; В.А. Парнес; Bjoerklund, и др.). Сущность ее сводится к следующему. В агар добавляют избыток антигена, реакцию с которым хотят исключить. При последующем проведении преципитации с несколькими антигенами полосы преципитата образуются только с антигенами, отличающимися некоторыми компонентами от антигена, введенного в агар. С антигеном, идентичным находящемуся в агаре, реакции преципитации не наступает, так как при избытке антигена в агаре образуется растворимый комплекс антиген— антитело, который, однако, не препятствует приципитации антителами других антигенов.

Реакцию задержки преципитации мы проводили в 1% растворе очищенного агар-агара, приготовленного на физиологическом растворе хлористого натрия. Готовый агар разливали в чашки Петри слоем 4—6 мм. Затем вырезали отверстия диаметром 5—7 мм, располагая их в виде шестиугольника с дополнительным отверстием в центре. Расстояние между краями отверстий было 5—7 мм. Во все лунки помещали по 1—2 капли нормальной сыворотки соответствующего животного. Диффузия белка в агар продолжалась в течение 2 суток. После этого лунки очищали пипеткой с резиновой грушей, в центральное отверстие вводили 1—2 капли преципитирующей сыворотки, а в периферические — по 1—2 капли исследуемых антигенов в виде концентрированных (коричневого цвета) вытяжек из пятен крови. Реакцию ставили при комнатной температуре. Результаты учитывали через 2—4 суток и фотографировали контактным путем на сверхконтрастных фотопластинках, отпечатки с которых получали посредством фотоувеличителя.

По данной методике провели опыты с вытяжками из пятен крови коровы, барана и лося, с одной стороны, и с сывороткой, преципитирующей белок рогатого скота, — с другой.

Предварительно проведенной реакцией преципитации в агаре установили, что сыворотка, преципитирующая белок рогатого скота, образовывала полосы преципитата со всеми введенными в опыт вытяжками. Аналогичные исходные опыты с антигенами в той же концентрации и сыворотками тех же серий проводили и при других исследованиях с использованием реакции торможения преципитации в агаре.

При насыщении агара антигеном лося последующая реакция преципитации была резко положительной c вытяжкой из пятна крови коровы, положительной с вытяжкой из пятна крови барана и отрицательной с вытяжкой из пятна крови лося.

Если агар насыщался антигеном барана, то при последующей реакции преципитации полосы преципитата образовывались только с вытяжками из пятен крови коровы. С пятнами крови барана и лося реакция была отрицательной (рис. 1).

В том случае, когда в агар предварительно вводили антиген коровы, реакция преципитации была отрицательной со всеми исследуемыми антигенами (коровы, барана, лося).

Результаты опытов показывают, что в получении нужной направленности реакции преципитации большое значение имеет спектр антител преципитирующей сыворотки. Если антител, специфичных к интересующему нас антигену, очень мало или они отсутствуют, то из такой сыворотки получить нужную моноспецифическую сыворотку не удастся. Именно поэтому при насыщении агара антигеном коровы последующая реакция преципитации была отрицательной не только с пятнами крови коровы, но также и с кровью барана и лося.

Рис. 1. Реакция торможения преципитации в агаре (увеличено в 2 раза). Агар насыщен антигеном барана. Сыворотка, преципитирующая белок рогатого скота (в центре). Вытяжки из пятен крови коровы (К), барана (Б) и лося (Л).

Рис. 2. Схема реакции преципитации в агаре (по Абелеву).
АВ, АС — антигенные комплексы; ав, ас — преципитирующие сыворотки; Аа, Вв, Сc — линии преципитации в агаре.

Следовательно, в использованной нами сыворотке в достаточном количестве содержались только антитела, специфичные к белку коровы. Эта сыворотка, по данным Научно-исследовательского института судебной медицины, была получена иммунизацией только одним белком коровы. Поэтому истощать ее антигеном коровы оказалось нецелесообразным. Из этого можно сделать вывод, что для выявления компонентов антигена, присущих только белку барана, следует применять преципитирующую сыворотку, полученную при иммунизации подопытных животных белком барана.

Для подтверждения этого предположения поставили реакцию торможения преципитации с сывороткой, преципитирующей белок рогатого скота, полученной иммунизацией белком барана. При проведении простой реакции преципитации в агаре она давала полосы преципитата с пятнами крови барана и коровы. После предварительного насыщения агара антигеном коровы реакция преципитации была положительной с пятнами крови барана и отрицательной с пятнами крови коровы. В противоположном опыте, когда агар насыщался антигеном барана, последующая реакция преципитации была отрицательной с пятнами крови и коровы, и барана.

Опыты были поставлены также с сывороткой, преципитирующей белок птицы, и вытяжками из пятен крови курицы и индюка.

Проведение предварительной реакции преципитации в агаре показало, что эта сыворотка дает образование полос преципитации как с пятнами крови курицы, так и с пятнами крови индюка. При насыщении агара антигеном индюка последующая реакция преципитации была положительной только с пятном крови курицы. При введений в агар антигена курицы проводимая затем реакция преципитации была отрицательной и с пятнами крови курицы, и с пятнами крови индюка.

Таким образом, реакция торможения преципитации в агаре дозволяет легко получить преципитирующие сыворотки с более узким спектром антител, необходимые для более точного установления видовой специфичности крови и других биологических объектов. Получение таких моноспецифических сывороток для обычной реакции кольцепреципитации сопряжено с дополнительными трудностями. При этом, как правило, не удается полностью освободиться от перекрестных реакций с антигенами филогенетически близких видов животных. Предложенная реакция позволяет полностью исключить положительный результат за счет родственных антигенов.

Рис. 3. Реакция преципитации в агаре (увеличено в S раз). Вытяжка из пятна крови коровы (К). Сыворотки, преципитирующие белок мелкого (б) и крупного (к) рогатого скота. Х(Б)—вытяжка из исследуемого пятна крови барана.

Рис. 4. Реакция преципитации в агаре (увеличено в 6 раз). Вытяжка из пятна крови коровы (К). Сыворотки, преципитирующие белок мелкого (б) и крупного (К) рогатого скота. X(К) — вытяжка из исследуемого пятна крови коровы.

Для дифференцирования белков филогенетически близких животных можно использовать и другие модификации реакции преципитации в агаре.

Если имеется возможность реакцию преципитации провести с 2 так называемыми дифференцирующими сыворотками, например с сывороткой, преципитирующей белок крупного рогатого скота, и сывороткой, преципитирующей белок мелкого рогатого скота, то опыт лучше проводить в модификации Абелева, позволяющей сравнивать 2 полные системы антиген—антисыворотка. Для этого в агаре делают 4 отверстия на равном расстоянии друг от друга (рис. 2). В 2 левых резервуара помещают сравниваемые антигенные комплексы (АВ, АС), имеющие как общие, так и специфичные для каждого комплекса компоненты. В 2 правых резервуара выводят соответствующие преципитирующие сыворотки (ab, ас). Антигены должны располагаться к аналогичным сывороткам по диагонали четырехугольника (крест-накрест).

Таким путем достигается расположение полос преципитации, при котором они за счет антигенов, специфичных только для одной системы, отклоняются на всем своем протяжении от линий преципитации антигенов, общих для сравниваемых комплексов. Линии преципитации за счет общего компонента располагаются на схеме вертикально (Аа), а полосы преципитации со специфическими для каждой системы антигенами образуют перекрест (Вb, Сс).

В качестве примера можно привести реакцию, в которой одной системой является вытяжка из пятна крови коровы и сыворотка, преципитирующая белок крупного рогатого скота, а второй — вытяжка из пятна крови барана и сыворотка, преципитирующая белок мелкого рогатого скота (рис. 3). В результате реакции отчетливо заметны как вертикальные полосы преципитации за счет общих компонентов белков барана и коровы, так и перекрещивающиеся линии за счет антигенов, специфичных для крови барана и коровы.

Следовательно, реакцию преципитации в агаре в модификации Абелева можно использовать для дифференцирования белков филогенетически близких видов животных. Для того чтобы установить, например, происходит исследуемое пятно крови от крупного или мелкого рогатого скота, нужно взять одну стандартную систему антиген—антитело: вытяжку из пятна крови коровы и сыворотку, преципитирующую белок крупного рогатого скота. Вторую, сравниваемую систему будет представлять вытяжка из исследуемого пятна крови и сыворотка, преципитирующая белок мелкого рогатого скота. Вытяжки из пятен, как исследуемых, так и контрольных (стандартных), берут более концентрированные (коричневого цвета), чем для обычной реакции кальцепреципитации.

Если в результате проведения сравнительной реакции характер образованных линий преципитации будет такой, как на рис. 3, то следует заключить, что исследуемое пятно произошло от животного, относящегося к мелкому рогатому скоту. Если же пятно крови крупного рогатого скота, то характер реакции будет иным (рис. 4). В этом случае одинаковые антигены образуют сливающиеся вертикальные линии преципитации за счет антител, общих для 2 преципитирующих сывороток, участвующих в реакции. Кроме того, выявляются полосы преципитации, отклоняющиеся к одной из лунок с антисывороткой, за счет антител, имеющихся только в одной из 2 преципитирующих сывороток, в данном случае в сыворотке, преципитирующей белок крупного рогатого скота.

Если в качестве стандартной системы выбрать сыворотку, преципитирующую белок мелкого рогатого скота, и вытяжку из пятна крови барана, то результаты опытов с исследуемым пятном будут противоположными.

Помимо 2 описанных выше результатов, возможен третий вариант, когда при исследовании пятна крови выявляются различия при реакции с обеими стандартными системами. В этих случаях исследуемое пятно происходит от какого-то другого животного, близкого по своим филогенетическим связям. Уточнить это животное можно лишь, применив соответствующие преципитирующие сыворотки.

Таким образом, проведение опытов с 2 стандартными системами антиген — антитело надежно гарантирует исследователя от возможных ошибок и позволяет достоверно дифференцировать кровь филогенетически близких животных.

Выводы

1. Реакция торможения преципитации в агаре является простым методом получения из поливалентных сывороток моновалентных, необходимых для более точного определения видовой специфичности крови и других биологических объектов.
2. При наличии 2 так называемых дифференцирующих преципитирующих сывороток хорошие результаты дает реакция преципитации в агаре в модификации Абелева.
3. При помощи этих реакций можно легко дифференцировать кровь филогенетически близких животных, например мелкого и крупного рогатого скота и т.п.

¹ Судебно-медицинская экспертиза, 1964, № 4.