ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ФИКСАЦИИ

 

Фиксация обеспечивает стабилизацию тканевых структур и их уплотнение, прекращает аутолиз, стабилизирует локализацию структур. Механизм действия фиксаторов основан на коагуляции белков и стабилизации липидов. Для достижения этой цели возможны 3 подхода:

1.  Высушивание

2.  Замораживание

3.  Химическая фиксация:

·  Альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид)

·  хромовая кислота

·  тетраоксид осмия

·  спирты (этанол, метанол)

·  ацетон

·  соли ртути (сулема)

·  кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная)

 

Мы рассмотрим третий вариант. Прижизненно взятая ткань должна быть зафиксирована на протяжении (не больше)30-90 минут, температура фиксатора – 0-4С

Фиксация всегда приводит к большим или меньшим изменениям структуры и объема ткани, степень выраженности которых зависит от рН фиксатора, его концентрации, температуры, продолжительности воздействия и других факторов. Концентрация ионов водорода фиксатора должна соответствовать таковой в тканях, поэтому фиксатор должен иметь рН, близкий к нейтральному. Увеличение температуры фиксатора ускоряет процесс, но вызывает еще большие изменения в тканях. Слишком продолжительная фиксация приводит к значительному уплотнению материала, что в дальнейшем затрудняет его обработку. Для каждого конкретного вида исследования подбирают наиболее приемлемый фиксатор.

Полноценная фиксация материала обеспечивается при соблюдении ряда требований.

1. После вырезки кусочка ткани его немедленно погружают в фиксатор.

2. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 10—20 раз, так как тканевая жидкость может существенно изменить концентрацию фиксатора.

3. В том случае, если цвет фиксатора изменяется после по­гружения в него кусочков ткани, фиксатор необходимо немедленно сменить.

4. Недопустимо повторное использование фиксаторов.

5. Для каждого фиксатора следует соблюдать установленное время фиксации. Длительное пребывание материала возможно лишь в некоторых фиксаторах, например 10 % нейтральном формалине, жидкости Боуэна.

Для фиксации лучше использовать емкости с широким горлом, чтобы не возникло проблем с извлечением фиксированного материала. Равномерность фиксации некоторых рыхлых тканей, например легочной, достигается помещением их на дно банки, а поверх них — прокладки из слоя марли или ваты.

Чаще материал фиксируют при комнатной температуре, но для некоторых видов исследования (гистохимических, электронно-микроскопических и др.) необходимо проводить фиксацию при 4°С. Материал срочных биопсий фиксируют при повышенной температуре фиксатора.

В экспериментальных исследованиях применяют также прижизненный перфузионный метод фиксации и его сочетание с обычным погружением в фиксирующую жидкость.

 

ПРОСТЫЕ ФИКСИРУЮЩИЕ ЖИДКОСТИ

Химическая фиксация:

·  альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид)

·  хромовая кислота

·  тетраоксид осмия

·  спирты (этанол, метанол)

·  ацетон

·  соли ртути (сулема)

·  кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная)

 

1.  Альдегиды

Можно хранить месяцами, надо всего лишь контролировать рН.

Формалин. Основным, широко применяемым фиксатором служит формалин, представляющий собой 40% раствор формальдегида. Формальдегид – это газ, растворимый в воде до концентрации40% по массе, каким он и поступает в продажу под названием «Формалин». В гистологической практике используют 10% раствор формалина, что соответствует 4% формальдегиду.

.Из формальдегида готовят нейтральный (забуференный до рН 7,0) 10—12% формалин. Для этого в банку с 40% формалином засыпают карбонат кальция или магния либо смесь этих солей — доломит из расчета 100 г на 1 л формалина. Для получения 10 % нейтрального формалина через 24 ч к 1 части 40% нейтрального формалина добавляют 9 частей водопроводной воды. Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С

В водных незабуференных растворах Ф-д со временем превращается в муравьиную кислоту, метиловый спирт и ацетон, которые ухудшают качество фиксации, как и выпадение белого осадка параформальдегида. В результате точную Со Ф-да в растворах формалина установить не представляется возможным. Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70—80° С (в вытяжном шкафу!), и использовать для фиксации. Очищенный коммерческий параформальдегид применяют как составную часть многих фиксаторов для гистохимических и электронно-микроскопических исследований.

Фиксатор может показывать себя не с лучшей стороны из-за примесей, в основном метанола(до16%).Для этого существуют методы приготовления свободного от метанола

4% ф-д по Гайеру

·  2гр параформальдегида + 50мл 0,1М фосфатного буфера(рН 7,4-7,6)=нагревают до 70с до просветления раствора, помешивают, охлаждают и фильтруют. Его рН 7,3-7,5.

40% ф-д по Глауерт

·  готовят 40% параформальдегид(40гр порошка формальдегида + 100мл дистиллированной воды при нагревании до 65С, перемешивая.

+ несколько капель 40%гидроксида натрия до просветления раствора.

 

Солевой формол.

·  Нейтральный 40% формалин 100 мл

·  Хлорид натрия                          8,5 г

·  Водопроводная вода                900 мл

Продолжительность фиксации 48 ч при 20 ° С с последующей промывкой в проточной воде в течение 6—12 ч.

 

Универсальным фиксатором, пригодным для гистологических и большинства гистохимических исследований, является нейтральный формалин по Лилли).

1.  А. 100 мл 40 % формалина + 900 мл дистиллированной воды.

2.   Б. 4 г дигидроортофосфата натрия моногидрата (однозамещенного фосфата натрия).

3.  В. 6,5 г гидроортофосфата натрия (двузамещенного фосфата натрия).

 

Фиксатор Лилли для кислых гликозаминогликанов

1.  Нитрат свинца                                  8гр

2.  40% раствор формальдегида          10мл

3.  вода                                                    10мл

4.  этанол                                               80мл

продолжительность фиксации 24 часа при комнатной Т( при 4С – 2-3дня, 10-14 дней при –25С).

Фиксатор Жандра для гликогена

1.  Пикриновая кислота, насыщенная в 96% спирте             85 частей

2.  Раствор формальдегида 40%                                               10 частей

3.  Ледяная уксусная кислота                                                     5 частей

Глутаровый альдегид для ферментов.

Обеспечивает наибольшую сохранность ферментов.

·  0,2М фосфатный или какодилатный буфер(рН 7,2-7,4)            50л

·  ДВ                                                                                                     40мл

·  25%глутаровый альдегид                                                            10мл

·  сахароза                                                                                         8,5гр

 

2.Тетраоксид осмия.

Приводит не коагулируются, а желатинизируются, ткани не сморщиваются. Одновременно является контрастирующим веществом в электронной микроскопии. Дорогой реагент, поступает в продажу в ампулах по 0,5 – 2 гр. Разбивают в бумаге и помещают в

 воду больше 24ч для 1-4 % раствора. Хранят в темноте при комнатной температуре месяцами. Для первичной фиксации липидов используют 1% раствор на 0,1М фосфатном буфере. Для 1 фиксации

·  2% ТО в ДВ                            5мл

·  натрия хлорид                        850мг

·  0,2М фосфатный буфер          5мл

Для вторичной используют сахарозу вместо натрия.

Раствор Флеминга

·  2% ТО на дв                                           2мл

·  1% раствор хромовой кислоты на дв  7,5мл

·  ледяная уксусная кислота                                  0,5мл      (смешивать перед использованием)

 

3.Хромовая кислота.

Для стабилизации липидов, для фиксации гликогена и нуклеиновых кислот.

            Фиксатор Элфтмана (бихроматсулема)

·  Сулема                     5 гр.

·  Бихромат калия       2,5 гр.

·  ДВ                             100мл

Продолжительность фиксации 3 дня.

 

4.Этиловый спирт (80 %, 90 %, 96 % и 100 %).

 Его применяют для осаждения белков, в качестве фиксатора для выявления гликогена, железа, амилоида, но он растворяет липиды. Механизм действия основан на осаждении белков, при этом происходит обезвоживание объектов, что значительно ускоряет проводку. Продолжительность фиксации от 2ч до 1 суток. Увеличение длительности фиксации, особенно в 100 % спирте¹, нежелательно, так как материал значительно уплотняется и происходит его пересушивание. Оптимальная температура для фиксации материала в спирте +4 °С, но ее можно проводить и при комнатной температуре. Если после спиртовой фиксации предстоит резать ткань на замораживающем микротоме или криостате, то кусочки промывают в течение 1 —2 ч до их полного погружения на дно банки, при этом происходит насыщение ткани водой.

5.Уранилацетат

Используют в электронной микроскопии как третий фиксатор (после альдегида и тетраоксида осмия) и одновременно как контрастер. Хорошо выявляет мембраны благодаря стабилизации фосфолипидов, стабилизации ДНК .Применяют 0.25-2% в воде или в 50-70% спирте (окрашивание 8 минут).

Ацетон (его действие подобно действию спирта). Ацетон используют для увеличения скорости фиксации. Применяют 100% ацетон, для получения которого в коммерческий ацетон засыпают прокаленный сульфат меди (медный купорос) или силикагель. В ацетоне фиксируют кусочки толщиной 3—4 мм в течение 2 ч при 20° С или 30 мин— 1 ч в термостате при 60 °С в плотно закрытой посуде. Ацетон значительно уплотняет ткань и при увеличении продолжительности фиксации возможно сморщивание объектов. Чаще ацетон применяют для обработки материала срочных биопсий при его заливке в парафин.

6.Кислоты.

Азотная, пикриновая, уксусная, трихлоруксусная. Быстро проникают, препятствуют сморщиванию,

 ослабляют состояние гидратации. Входят в состав декальцинирующих смесей.

Фиксатор Жандра для гликогена

4.  Пикриновая кислота, насыщенная в 96% спирте             85 частей

5.  Раствор формальдегида 40%                                               10 частей

6.  Ледяная уксусная кислота                                                     5 частей

 

Жидкость Буэна

 классический фиксатор для экспериментальных исследований.

·  Насыщенный раствор пикриновой кислоты    75 мл

·  Нейтральный 40 % формалин                            25 мл

·  Ледяная уксусная кислота                                     5 мл

Продолжительность фиксации 1—24 ч при 20 °С. Насыщенный раствор пикриновой кислоты готовят заранее из расчета 3 г кристаллической пикриновой кислоты на 1 л горячей дистиллированной воды. После фиксации кусочки отмывают от избытка пикриновой кислоты в 70 % спирте, затем заливают в парафин.

Жидкость Карнуа

универсальный фиксатор для большинства гистологических и гистохимических исследований (кроме выявления липидов). Наилучший для кожи, для предупреждения пересушивания в качестве промежуточной среды используют хлороформ.

·  Спирт 100 % или 96 %        60 мл

·  Хлороформ                            30 мл

·  Ледяная уксусная кислота   10 мл

Продолжительность фиксации 2—4 ч при 4 ° С или 1—2 при 20 °С. Затем материал помещают в 100 % спирт. Если материал не сразу подлежит проводке, то его можно перенести 96 % спирт и держать в нем до 3 суток.

            Сюда также входят фиксирующие смеси по Боуену, Жандру, Карнуа, Лилли, Ценкеру, Бродскому, прочее.

7.Сулема (дихлорид ртути).

Сулему применяют в качестве фиксатора с начала развития гистологии. Готовят насыщенный раствор: 10 г сулемы на 100 мл дистиллированной воды или изотонического раствора хлорида натрия доводят до кипения, охлаждают, фильтруют. Продолжительность фиксации кусочков толщиной 3 мм 6—12 ч при 20 °С. При фиксации сулемой возможно появление в тканях кристаллического осадка, который удаляют путем обработки срезов йодированным 70 % спиртом (на 50 мл 70 % спирта — 5—10 капель 5 % спиртового раствора йода до появления оранжевого цвета). По мере обесцве­чивания йодированного спирта со срезами его заменяют свежей порцией вплоть до полной потери цвета, затем срезы промывают в 3—4 сменах 70 % спирта.

 

СЛОЖНЫЕ ФИКСАТОРЫ

Составными частями сложных фиксаторов являются простые. Существует множество вариантов фиксирующих смесей. Ниже приведены наиболее распространенные.

Спирт-формол по Шаферу.

·  10 % нейтральный формалин, который готовят из 1 части нейтрального 40 % формалина и

·  2—3 частей 96 % спирта.

Продолжительность фиксации 24-48 ч. Дальнейшая промывка в воде не требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт.

 

Кальций-формол по Бейкеру (Проверено) используют для фиксации липидов.

·  10 мл 40% формалина + 90 мл дистиллированной воды.

·  1 г хлорида кальция.

Растворы   смешивают.

Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С.

Для гистохимических исследований с успехом применяют фиксатор Бейкера, приготовленный из параформальдегида.

·   К 50 г параформальдегида и 500 мл дистиллированной воды добавляют с одновременным встряхиванием несколько капель 1 н. гидроксида натрия до исчезновения осадка.

·  10 г хлорида кальция + 500 мл дистиллированной воды.

Растворы  А и Б смешивают, добавляют 0,5 г активированного угля. Перед использованием фильтруют.

Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С.

 

Используется также фиксатор Карнуа, в состав которого входят

·  75 мл 100 % спирта

·  25 мл ледяной уксусной кислоты

Условия фиксации те же. В случае отсутствия этилового спирта вместо жидкости Карнуа можно использовать смесь следующего состава:

·  Изопропиловый спирт 60мл

·  Пропионовая кислота 30м

·  Ацетон              10мл

·  Диоксан             10мл

Продолжительность фиксации 12-24 ч при 20 °С; для промывки и обезвоживания применяют изопропиловый спирт.

 

Жидкость Ценкера — сулемовая смесь.

·  Бихромат калия   2,5г

·  Сульфат натрия   1 г

·  Дистиллированная вод100мл(это-жидкость Мюллера).

·  Сулема            5г

·  Ледяная уксусная кислота 5мл

Ледяную уксусную кислоту можно заменить нейтральным 10 % формалином (фиксатор Максимова, ценкер-формол). Продолжительность фиксации 1—24 ч при 20°С. После фиксации материал в течение 12—24 ч отмывают в проточной воде и помещают в йодированный 70% спирт для удаления остатков сулемы. При добавлении 10 мл 2 % раствора тетраоксида осмия хорошо фиксируются и окрашиваются липиды.

В последнее время для гистологических исследований часто применяют глутаровый альдегид, параформальдегид, фиксаторы Ито, Замбони и др., особенно в тех случаях, когда материал предназначается одновременно для нескольких видов исследования (иммуноморфологического, электронно-микроскопического), а его количество ограничено,  например, при пункционных биопсиях.

 

ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФИКСАТОРАМИ

Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам (альдегиды, ацетоны, спирты), некоторые ядовиты (сулема, тетраоксид осмия, метанол), поэтому необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами, которые используют в гистологической практике.

Фиксацию и вырезку материала необходимо производить в вытяжном шкафу. Материал, извлеченный из фиксатора, содержащего формалин, желательно в течение нескольких минут промыть в проточной воде, так как пары формалина оказывают раздражающее действие на слизистые оболочки глаз и органов дыхания.

 

БЫСТРАЯ ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА СРОЧНЫХ БИОПСИЙ

Доставленный в лабораторию материал в случае необходимости вырезают или разрезают на несколько кусочков и фиксируют с помощью одного из способов быстрой фиксации. Если возможно, то следует часть материала сохранить для изготовления постоянных препаратов.

1. Материал помещают в металлический сосуд с ручкой и заливают теплым 10% нейтральным формалином, доводят до кипения, затем промывают проточной водой в течение 2—5 мин и режут на замораживающем микротоме или криостате.

2. Кусочки фиксируют в 100 % ацетоне в термостате при 56°С в течение 15 мин, затем помещают в хлороформ или ксилол для последующей заливки в парафин.

3. Материал фиксируют в смеси 10 % нейтрального формалина и 96 % спирта (1:1) в течение 15 мин при 56°С, затем промывают в 96 % спирте и обезвоживают в 100 % спирте.

4. М. Vinci и соавторы (1990) предложили метод фиксации кусочков ткани объемом 0,5—1 см³ с применением микроволновой техники. Материал в растворе альдегида помещают на 20с в микроволновую печь (2,5 Гц/500 В), а затем оставляют на 10— 30 мин при комнатной температуре в том же фиксаторе. Микроволновое излучение способствует быстрому проникновению альдегидов в клетки и ткани, в результате чего улучшается качество фиксации. Этот способ позволяет проводить не только обычные гистологические, но и ультраструктурные цитохимические, иммуноморфологические исследования, а также рентгенологический микроанализ.

 

ВОЗМОЖНЫЕ АРТЕФАКТЫ, СВЯЗАННЫЕ С ФИКСАЦИЕЙ, И ИХ УСТРАНЕНИЕ

При фиксации формалином, особенно кислым, возможно появление в срезах темно-коричневого пигмента в виде зернышек или глыбок (результат реакции формалина с гемоглобином ткани). Пигмент удаляют, помещая срезы на 15—20 мин в 1—5 % раствор аммиака или 70 % спирт. После промывания водой препарат можно окрашивать. Хорошо удаляется пигмент в растворе 1 % гидроксида калия в 80 % спирте (1:25): после 10-минутной экспозиции препарат промывают в проточной воде в течение 5 мин.

В случаях значительного уплотнения ткани в результате слишком продолжительной фиксации кусочки помещают на 1—2 ч в 10% раствор лимонной кислоты, в результате чего материал становится более мягким и пригодным для исследования.

Кристаллический осадок, образующийся после фиксации с применением сулемы, удаляют из кусочков или лучше срезов с помощью йодированного 70 % спирта.