Заливка гистологического материала

ЗАЛИВОЧНЫЕ СРЕДЫ

Для получения тонких (до 6 мкм) гистологических срезов необ­ходимо фиксированный и промытый материал залить в плот­ную среду, предварительно пропитав ею кусочки тканей. В за­висимости от способа растворения все заливочные среды разде­ляют на растворимые в органических растворителях и водорас­творимые. К первым относятся парафин, пластические полиме­ры на основе парафина, целлоидин, ко вторым — желатин, полиэтиленгликоли, полиэфиры, некоторые метакрилаты и т.д.

1.Заливка ткани в парафин

Парафин — смесь высокомолекулярных предельных углеводо­родов, продукт перегонки нефти; растворяется в анилине, бен­золе, бергамотном масле, целлозольве, хлороформе, декалине, диоксане, бутаноле, пропаноле, толуоле, трихлорэтилене, кси­лоле. Каждый из этих растворителей можно использовать в ка­честве промежуточной среды между спиртом и парафином. Тем­пература плавления различных парафинов от 27 до 62 °С. В гистологической технике применяют парафин с температурой плавления 56 °С. Зарубежные фирмы производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий раз­личные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид. Их коммерческие названия «Парапласт», «Парапласт плюс», «Гистопласт С», «Гистозес».

Важнейшим условием успешной заливки материала является своевременная смена реактивов в процессе их загрязнения, а также соблюдение рекомендуемых временных и температурных параметров. Кроме того, нужно стремиться к тому, чтобы одновременно заливать одинаковые по толщине и плотности кусочки ткани.

	Схема Меркулова	Схема Волковой—Елецкого
Фиксация:	формалин 10 %                    24 ч спирт-формол                      24 ч жидкость Карнуа             2 – 4 ч спирт 96-100%               2 – 24 ч промывание в       проточной воде            12 - 24 ч
Обезвоживание:	спирт 96 % I               24 ч спирт 96 %II                 2 ч спирт 100 % I             24 ч спирт 100 % II              2 ч	спирт 50%                       2 - 4 ч спирт 60 %                      2 - 4ч спирт70%                      12 - 24ч спирт 96 %I                         12 ч спирт 96 % II                       12 ч спирт 100 % I                   1-12 ч спирт 100 % II                     12 ч
Заливка в парафин:	спирт+хлороформ (1:1)        6-12ч или спнрт+ксилол (1:1)               1-3ч или хлороформ                           6-12ч или ксилол                                   1-6ч хлороформ+парафин (1:1 — «каша») 37 "С                         2-3ч или ксилол+парафин (1:1 — «каша») 37 °С                                             1-2ч napaфин I 56 °С                          2ч парафин II 56 °С                        1ч	спирт 100 % + хлороформ (1:1) 2-3ч хлороформ I                           1,5ч хлороформ II                          0,5ч хлороформ III                         0,5ч хлороформ+парафин (1:1) 37°С                              3-6ч хлороформ+парафин (1:1) 56°С 0,5-1ч парафин I 56°С                         2ч парафин II 56°С                       2ч парафин III 56°С                      1ч

Другие способы заливки.

 

Заливка по Ромейсу ручным способом 1 вариант	Заливка по Ромейсу ручным способом 2 вариант	Заливка в парапласт с помощью автомата	Заливка в парапласт с помощью вакуум-автомата.	Быстрая заливка в парапласт с помощью автомата
Фиксация 10% формалин  12ч	10% формалин 12ч	Фиксация в 5 % формалине 2ч		Фиксация в 5 % формалине при 60 °С 10мин
Промывание в проточной воде  2ч	Промывание в проточной воде                 2ч	Спирт 70 % I 2ч	Спирт 70 % I 5 мин	Ацетон I 30мин
50% спирт   2ч	50% изопропиловый спирт 2ч	Спирт 70 % II 1ч	Спирт 70 % II 12мин	Ацетон II 30мин
75% спирт    3ч	75%               3ч	Спирт 96 % I 1ч	Спирт 96 % I 12мин	Ацетон III 30мин
96%               4ч	90%               6ч	Спирт 96 % II 1ч	Спирт 96 % II 12мин	Ацетон IV 30мин
100% I           4ч	100% Изопропиловый спирт I                  4ч	Спирт 100 % I 1ч	Спирт 100 % I 12 мин
100% II          4ч	100%  II         4ч	Спирт 100 % II 1ч	Спирт 100 "о II 12мин
Метилбензоат  I                                          2ч	Изопропиловый спирт+парафин (1:1) 60*С    12ч	Спирт 100 % III 1ч	Спирт 100 "о III 12мин
Метилбензоат  II                 2ч		Хлороформ I (бензол) 1ч	Бензол I 15мин	Ацетон-ксилол (1:1) 10мин
Бензол          2ч		Хлороформ II (бензол) 1ч	Бензол II 15мин	Ксилол 10мин
Бензол+парафин(1:!)                   1ч		Парапласт I 60 °С 2ч	Парапласт плюс I 60 °С 15мин
Парафин 60*С                                              8ч	Парафин 60*С                                             8ч	Парапласт П 60 'С 3ч	Парапласт плюс II 60 °С 25мин	Парапласт плюс 60 °С 30мин
Всего        47ч	Всего           54ч	17ч	12 ч 27  мин	3 ч

Наиболее быстрым, простым, не требующим применения специальной аппаратуры методом заливки материала является способ, разработанный И. И. Золотых в патологоанатомическом отделении Института хирургии им. А. В. Вишневского.

96 % спирте                                           15 мин

100 % Спирт                                          15 мин

Хлороформ                                             15 мин

Хлороформ-парафин при 56 °С           15 мин

Парафин при 56 °С, энергично встряхивая 1 мин

Парафин при 56 °С                                45 мин

  Продолжительность                     2 ч 30 мин

            У нас заливка проходит следующим образом:

Формалин 10%                                                   24 часа

Промывка проточной водой                                1 час

спирт 70% (обезвоживание)                   больше 4 часов

спирт 80%                                                  больше 4 часов

спирт 96%                                                  больше 4 часов

спирт+хлороформ 1:1                                          до 1 часа(пересушивается)

хлороформ чистый                                               до 1 часа

хлороформ чистый                                               до 1 часа

хлороформ+парафин 1:1 37С                               до 1 часа

парафин 1   56С                                                            45 м

парафин 2   56С                                                            45 м

в блоки.

Для приготовления препаратов следует:

ксилол 1 (депарафинизация)   56С                               10 м

ксилол 2   56С                                                                 10 м

фильтровальная бумага(промокашка)

спирт 96%                                                                          5 м

спирт 70%                                                                          5 м

фильтровальная бумага

гематоксилин                                                                     5 м

промываем дистиллированной водой

эозин                                                                                   до 2 м

вода водопроводная

спирт макнуть

фильтровальная бумага

ксилол   56С                                                                     больше 10 м (для просветления)

 

Особенности заливки в парафин крупных объектов

Заливка в парафин позволяет получать гистологические срезы больших размеров (гистотопографические срезы), например срезы всего органа (матка, почка) или его значительной части (доля легкого). Заливку проводят вручную, и для нее требуется дополнительное время на всех этапах. Для приготовления таких срезов из ткани головного мозга с помощью мозгового ножа де­лают срез свежей ткани толщиной около 1 см и закладывают в ванну с фиксатором. Для того чтобы сохранить плоскую конфи­гурацию среза, его кладут между двумя проволочными сетками, которые притягивают друг к другу резиновыми кольцами. Про­должительность фиксации 48 ч. После промывки в проточной воде (3—4 ч) следует обезвоживание в 70 %, 96 % и 100 % спир­те (по 2 смены) в течение 48 ч. Для обезвоживания можно при­менить изопропиловый спирт, обеспечивая частую его смену и температуру 45 °С (в термостате). Это позволяет избежать по­лучения чрезмерно жестких препаратов. В качестве промежу­точной среды используют метилбензоат или хлороформ — 3 смены по 3 дня. Объекты заливают в парафин или парапласт, имеющие температуру плавления 56—58 °С.

Приготовление парафиновых блоков

Пропитанные парафином кусочки ткани выкладывают в специ­альные формочки и заливают расплавленным в термостате или на водяной бане при 60 °С парафином, в который добавлено 1 — 3 % воска.

Для получения парафиновых блоков нужной формы исполь­зуют различные приспособления. К ним относятся изготовляе­мые самим лаборантом бумажные коробочки, на дно которых выкладывают кусочки, а рядом к боковой стенке ставят этикет­ку номером кнаружи; металлические Г-образные угольники или разъемные формочки, которые перед употреблением смазывают глицерином и помещают на нагретую металлическую пластин­ку, выполняющую роль дна формочек. Применяют также раз­личные пластмассовые коробочки и формы, в частности используемые в микробиологии, особенно при заливке мелких объек­тов, таких как материал пункционных биопсий.

Специальные импортные аппараты для заливки в парафин (так называемые заливочные центры) снабжены набором раз­личных формочек (кассет) и пинцетов. В них обеспечивается автоматическая подача дробных доз парафина оптимальной температуры.

Раскладывание кусочков в формочки и их ориентирование нужно проводить быстро теплым пинцетом. Если материала для заливки много и он быстро остывает, то можно использовать пара­фин, подогретый на водяной бане до 60 °С. Для охлаждения фор­мочки с материалом рекомендуют помещать в воду при 10— 18 °С, но не погружать в нее. При застывании парафина поверхность блока стягивается, и в нем образуется кратерообразное углубление. Это нужно учитывать при заливке кусочков и в дальнейшей работе с блоками. Парафин должен на 3—4 мм выступать над по­верхностью блока, если предстоит монтировать его на деревянную колодку. Возможны также заливка блока большим количеством парафина и резка без использования деревянных колодок, с успе­хом применяемая даже на санном микротоме.

В большинстве руководств рекомендуют после подравнивания и удаления лишнего парафина наклеивать блоки на дере­вянные бруски с помощью подогретого на спиртовке металли­ческого шпателя или скальпеля. Затем для обеспечения более прочного приклеивания основания блок оплавляют с четырех боковых сторон тем же горячим шпателем или скальпелем.

Заливка ткани в целлоидин

Целлоидин — хорошо растворяющаяся в эфире нитроклетчат­ка. В гистологической практике применяют 2 %, 4 % и 8 % рас­творы целлоидина, которые готовят из целлоидиновых пластин или отмытой от эмульсии и высушенной рентгеновской пленки.

Для приготовления 500 мл 2 % раствора целлоидина 10 г сухого целлоидина заливают 250 мл 100 % спирта и оставляют на 1 сут, затем добавляют 250 мл безводного эфира, который растворяет набухший в спирте целлоидин. Для приготовления 4 % и 8 % растворов количество целлоидина увеличивают со­ответственно в 2 и 4 раза. Растворы хранят в плотно закрытой посуде.

Заливка ткани в целлоидин стала в настоящее время менее популярной, чем парафиновая, и ее применяют главным обра­зом для обработки труднорежущихся тканей и объектов боль­ших размеров, с которых трудно получить хорошие парафино­вые срезы. Целлоидиновую заливку используют также в тех случаях, когда необходимо избежать воздействия на исследуе­мый материал высоких температур. Кроме того, заливка мате­риалов в целлоидин позволяет получить лучшие результаты при наличии в объектах больших полостей, лакун и слоев различ­ной консистенции.

Эфир и сухой целлоидин огнеопасны, поэтому при работе с ними необходима осторожность.

Обезвоженный материал помещают в смесь 100 % спирта с эфиром (1:1) на 4—6ч, переносят в 2 % раствор целлоидина на 2—3 дня, затем в 4 % и 8 % растворы на 5—7 дней в каждый. Пропитанный кусочек заливают свежим 8 % целлоидином и уп­лотняют в парах хлороформа (в эксикаторе). Уплотненный таким образом материал заливают 70 % спиртом для хранения. Вырезанные блоки наклеивают густым целлоидином на дере­вянные колодки на 1 суток перед резкой.

 

	Заливка в целлоидин по Меркулову	Заливка в целлоидин по   Ромейсу
Фиксация:	Формалин10%                          24 ч Жидкость Карнуа                 2 – 4 ч Спирт 96 %                               12 ч Промывание в воде после формалина 24—48 ч
Обезвоживание:	Спирт 96 %                            24 ч Спирт 100%                           24 ч	Спирт-эфир(1:1)                4 – 6 ч Целлоидин 2%                         2 д Целлоидин 4%                         2 д Целлоидин 8%                         8 д Целлоидин 16%   уплотнение в фиксаторе до образования поверхностной корочки в парах хлороформа. Спирт 70%                    хранение
Заливка в целлоидин	Спирт 100 % +эфир (1:1)   6 –24 ч Целлоидин 2 %                 2 - 4 дня Целлоидин 4 %                    2 – 4 д Целлоидин 8— 10%            1 – 2 д Хлороформ                           2 – 3 д Спирт 70 %                     хранение

Особенности заливки в целлоидин крупных объектов

                Целлоидиновая заливка, так же как и заливка в парафин, позволяет получать гистотопографические срезы. Пластины ткани органа толщиной 1 см кладут между двумя проволочными сетками (как для заливки в парафин), фиксируют, промывают и обезвоживают. Общая продолжительность процесса заливки в целлоидин крупных объектов 2—2,5 мес. С помощью целлоидиновой заливки можно получить гистотопографические срезы толщиной около 20 мкм.

Заливка в целлоидин-парафин

                Этот метод рекомендуется для обработки объектов, которые легко сжимаются при парафиновой заливке, например органов кроветворения, мезенхимной ткани, а также органов и тканей, имеющих многослойное строение (трахея, кожа и др.).

            Используют также смесь целлоидина с касторовым маслом (1:1), пребывание в которой объектов в течение 1—2 дней улуч­шает их пропитывание. Затем для удаления касторового масла материал промывают в трех порциях хлороформа.

 

Схема заливки в целлоидин материала для гистотопограмм по Меркулову		Заливка в целлоидин-парафин	Заливка в желатин по Волковой-Елецкому	Заливка в желатин Гаскелла-Граффа
Формалин 10—15 %   1—2 н Промывание в проточной воде                    24 ч Спирт 70 %                              1-2 д Спирт 96 % I                        1—2 д Спирт 96 % II                            3-4д Спирт 96 % III                               5 д Спирт 100 %                               2 д Спирт 100 %+эфир (1:1)                           4-5 д Целлоидин 2%                         2—3н Целлоидин 8%                        7—10д Хлороформ (уплотнение блоков)                         4—7 д Спирт 70 % хранение	Формалин 10%                               24ч Промывание в проточной воде                       6—12 ч Обезвоживание в спиртах     2—3 д Спирт 100% + эфир (1:1)                           3-6 ч Целлоидин 2%                          1—2 д Хлороформ      18ч Хлороформ + парафин (1:1)37°С                         2—3 ч Парафин I 56°С                           1-2 ч Парафин II при 56°С         1 —2 ч		Формалин10%                         24-48ч Промывание в проточной воде                       18—24ч Желатин 12,5 % при 37 °С в закрытой посуде     3-20 ч (в зависимости от величины объекта) Желатин 25 % при 37 °С   3-20 ч Заливка свежим 25 % желатином в формочки Застывание в формочках в холодильнике Формалин 20-25  % (уплотнение блоков)                    24 ч Формалин 10 % хранение	Формалин 10%                             48ч Промывание в водопроводной воде        2—6 ч Желатин 10 % при 37 "С  2-6ч Желатин 20 % при 37 'С  2-6ч Заливка в свежую порцию 10 % желатина при 37 "С Застывание формочек с кусочками в холодильнике Вырезка блоков Уплотнение блоков в 10 % формалине

 

Заливка в желатин

Для исследования липидов в рыхлых тканях и органах, а также .при изучении эмбриональных объектов с успехом применяют заливку в водорастворимый биополимер желатин. Используют прозрачный кристаллический пищевой желатин, из которого готовят 25 % и 12,5 % растворы.

К 25 г желатина добавляют 75 мл 1 % водного раствора фе­нола (карболовая вода) и помещают в термостат при 37 °С. Желатин набухает, и после перемешивания образуется густой 25 % раствор. Из него при разбавлении теплой (37 °С) карболовой водой в 2 раза получают 12,5 % раствор желатина.

Приготовленные растворы разливают в чистые сухие про­бирки для однократного использования и закрывают пробкой. В застывшем состоянии желатин можно долго хранить в темном прохладном месте.

Схема заливки в желатин по Волковой—Елецкому

Залитый в желатин материал режут на замораживающем микротоме. Из полученных срезов удаляют желатин, чтобы из­бежать окрашивания фона. Для этого срезы помещают на 30 мин в 10 % раствор гидроксида калия при 37 °С. Затем их про­мывают в водопроводной воде и окрашивают. Окрашенные срезы заключают в поливиниловый спирт или глицерин-жела­тин.

Приготовление поливинилового спирта: порошок поливини­лового спирта отмывают в 96 % спирте (2 смены), эфире (3 сме­ны) и высушивают. К 16 г отмытого порошка добавляют 100 мл дистиллированной воды, оставляют на 12 ч для набухания. По­лученную массу нагревают в течение 20—30 мин на кипящей во­дяной бане. На поверхности густой мутноватой жидкости обра­зуется пленка с пузырями, которую удаляют, а раствор фильт­руют через 4 слоя марли. Поливиниловый спирт можно исполь­зовать как промежуточную среду для получения постоянных препаратов после резки на замораживающем микротоме. Снача­ла на срез, расправленный на стекле, наносят поливиниловый спирт, затем после образования тонкой пленки (через 6—12 ч) препарат заключают в полистирол или бальзам.

Приготовление глицерин-желатина: к 7 г желатина добавля­ют 41 мл дистиллированной воды и оставляют для набухания 3—4 ч. Затем добавляют 50 мл глицерина и 1 г фенола. Смесь нагревают на водяной бане, постоянно помешивая. Раствор фильтруют через крупнопористый фильтр, разливают по про­биркам, закрывают пробками и хранят в холодильнике.

Срезы ткани, залитой в желатин, полученные на заморажи­вающем микротоме, можно обезводить в спиртах, просветлить в карбол-ксилоле и заключить в бальзам или полистирол.

В других схемах рекомендуют иные концентрации желатина и продолжительность пребывания в нем объектов.

Заливка в водорастворимые пластмассы

Для целей гистохимии, особенно для выявления липидов и фер­ментов, хорошо себя зарекомендовала заливка ткани в синтети­ческие водорастворимые пластмассы — полиэтиленгликоль, поливакс, метилметакрилат и др.

 

Заливка в полиэтиленгликоль различной молекулярной массы по Ринерхарту—Абуль-Хею Вариант 1	Заливка в полиэтиленгликоль различной молекулярной массы по Ринерхарту—Абуль-Хею Вариант 2	Заливка в поливакс по Стидмену	Заливка в метилметакрилат по Хиршу—Болларду
·          Формалин5%                         24-48ч ·          Промывание в проточной воде                               12ч ·          Полиэтиленгликоль-400 + дистиллированная вода (1:1)      30м ·          Полиэтиленгликоль-400 + дистиллированная вода (3:1)      30м ·          Полиэтиленгликоль-400    30м ·          Полиэтиленгликоль-1000 40"С            30 м ·          Заливка смесью полиэтиленгликоль-1550 + полиэтиленгликоль-4000 (1:9) при 58 "С      30 м	Формалин5%                        24-48 ч Промывание в проточной воде                             12 ч Заливка смесью полиэтиленгликоль-1550 + полиэтилен-гликоль-4000 (1:9) при 58 "С        1—3ч Заливка свежей порцией смеси при 58 "С      30 м Заливка смесью при 58 "С	Формалин 5 %                    6—24 ч Промывание в проточной воде 6— 12ч Обезвоживание в 70 % и 96 % спиртах                            24 ч Спирт 96 % + поливакс (1:1)                               2ч Поливакс 40"С                             Зч Свежая порция поливакса при 40 "С            3 ч Заливка в поливакс при 40 "С Застывание блоков при комнатной температуре	Формалин 5 %                    6— 12 ч Промывание в 70 % спирте    10 м Споласкивание в 96 % спирте   2 м Спирт 96 %    2ч Метилметакрилат                  2 ч Смесь (А+Б+В+Г) при 50 "С                2ч Свежая порция этой смеси при 50 -60 "С   6 - 10ч Затем материал выдерживают при комнатной температуре в течение 1 суток

 

Заливка в полиэтиленгликоль различной молекулярной массы по Ринерхарту—Абуль-Хею

Срезы с залитых в полиэтиленгликоль блоков готовят на замораживающем микротоме, окрашивают, помещают на предмет­ное стекло и заключают в смесь глицерина и желатина или рас­твор диэтиленгликоля (диэтиленгликоля — 4 части, дистилли­рованной воды — 5 частей, 40 % формалина — 1 часть).

Заливка в поливакс по Стидмену

Поливакс (полиэстервакс) представляет собой смесь полиэтилен-гликоля-400-дистеарата и ацетилалкоголя в соотношении 9:1.

Заливка в метилметакрилат по Хиршу—Болларду

Смола имеет сложный состав и состоит из четырех компонен­тов, которые смешивают в определенной последовательности:

1.      10 мл метилметакрилата (А)

2.      + 5 мл полиэталенгликоля (Б)

3.      + 3 мл дибутилфталата (В)

4.      + 0,2 г бензоилпероксида (Г).

Для парафиновых блоков используется плоский-плоский микротом(нож), а для других – плоский-вогнутый. Угол:13-15 градусов. Сначала равняют поверхность, потом срезают и бросают в воду при 35-40С,(если в воду добавить несколько капель казеинового клея, то фиксация будет намного лучшей и отсутствует фон), после чего вылавливают на обезжиренные предметные стёкла. Во время срезов целлоидина поверхность обильно смачивают спиртом с помощью кисточки.

После этого стекло со срезом подсушивают(6-12 часов при 37С или 10-15 мин при 56С.Во втором случае срез лучше фиксируется, но требует дополнительной порции ксилола и увеличения продолжительности депарафинизации).Способ для отличных по качеству срезов – сушка на спиртовке или нагреваемом столике.

Ошибки.

данные	причина	Устранение
Крошится парафин	Слишком твёрд Медленно охлаждался при заливке Низкая Т окружающей среды Большой угол наклона ножа	Подышать на блок Изменить угол наклона ножа Перезалить объект
Ткань отделяется от парафина	Заливка проводилась холодным парафином Плохая пропитка материала При проводке остались следы спирта	Перезалить блок, предварительно поместив его в промежуточную среду для удаления спирта
Материал плохо режется ткань белесоватого цвета срезы сморщенные, плохо расправляются	Недостаточное обезвоживание ткани	Блок расплавляют в термостате и пропускают по батарее в обратном порядке до 100% спирта, затем снова заливают по схеме.
Нож «подскакивает», не срезая ткань или на срезах образуются поперечные борозды	Переуплотнение или пересушивание материала при фиксации или обезвоживании	Резать материал, поместив на него кусочек льда Взять из архива новый и провести по схеме
Срезы сморщенные, прилипают к поверхности ножа, закручиваются	Недостаточный угол наклона ножа Высокая температура в помещении Материал залит в легкоплавный парафин	Изменить угол наклона ножа Перед срезами материал поместить в холодильник Перезалить в более тугоплавкий парафин
Срезы покрыты полосами и легко раскрываются	Плохое качество ножа: зазубрины Загрязнение парафина: плотные соринки Наличие в ткани солей кальция	Сменить или передвинуть нож Декальцинировать Использовать специаль-ные ножи(для керамики, синтетики, плотных тканей)
Срез прилипает к ножу	электризация	Подышать на блок