Подготовка костного материала для гистологического исследования

ФИКСАЦИЯ КОСТНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Первый этап обработки кусочков кости — фиксация, цель которой:

1.  закрепить структуру костной ткани в том состоянии, в каком она находилась в момент ее погружения в фиксирующую жидкость;

2. предохранить ее от дальнейшего разрушения;

3. подготовить костную ткань к последующей обработке.

Для фиксации костной ткани наиболее пригодны фиксирующие жидкости, содержащие формалин, так как при последующей декальцинации меньше набухает ткань, содержащая коллаген. С целью выявления извести (солей кальция) в костной ткани в качестве фиксатора чаще всего используют этиловый спирт. Формалин, смеси с пикриновой кислотой й фиксаторы, содержащие трихлоруксусную и уксусную кислоты, обладают слабовыраженными декальцинирующими свойствами, что важно учитывать при фиксации кусочков костной ткани.

Продолжительность фиксации в каждом фиксаторе можно указать только примерно. Надрезая острой бритвой толстые куски фиксируемой ткани, по изменению окраски и плотности ткани можно удостовериться, полностью ли проник фиксатор в ткань. Не следует передерживать объекты в фиксаторах. Только в 10 % формалине и смеси Буэна кусочки костной ткани можно хранить неограниченно долго.

При работе с любыми фиксирующими жидкостями необходимо соблюдать общие правила фиксации, изложенные в главе 2.

Для фиксации костного материала используют формалин, зтиловый спирт, спирт-формол, жидкости Карнуа, Боуэна и др.

Формалин. Обычно используют:

• 10% раствор формалина, состоящий из 10 мл 40 % раствора формальдегида и 90 мл водопроводной воды;
• концентрированный нейтральный формалин, состоящий из 100 мл формалина и 10г мела или карбоната магния основного;
• 10 % нейтральный формалин, состоящий из 10 мл концентрированного нейтрального формалина в 90 мл водопроводной воды;
• хорошо зарекомендовал себя 5% раствор формальдегида на изотоническом растворе хлорида натрия.

Кусочки костной ткани фиксируют в течение 24—48 ч в хорошо укупоренной банке (материал в формалине может сохраняться годами), затем промывают в проточной воде (луч 2 сут) й проводят через спирты возрастающей концентрации.

Этиловмй спирт. Применяют как абсолютный, так й 96 "а спирт. Абсолютний спирт обладает преимуществом: благодаря резко выраженному коагулируюшему действию менее деформирует клеточные злементы. Но спирт имеет меньшую проникающую способность, чем формалин, поэтому кусочки костной ткани должны быть толщиной не более 0,5 см. Спиртовая фиксация, как правило, применяется в специальных случаях, например, для различных гистохимических методов й при исследований на соли кальция. 06'ьект помещают в спирт на 12—24ч, который за это время нужно 2—3 раза сменить.

Спирт с формалином (спирт-формол). Смесь готовят перед применением: 1 часть 10 % нейтрального формалина + 9 часте 96 % атипового спирта.

Кусочки кости фиксируют в течение 24 ч, а затем помещают в 96 % или 100 % спирт.

Жидкость Карнуа. Смесь содержит 6 частей 100 % спирт, З части хлороформа и 1 часть ледяной уксусной кислоты. Применение этой жидкости показано в тех случаях, когда необходимо ускорить исследование. Соединительная ткань при фиксации слегка сморщивается. Кусочки костной ткани толщиной 2 до 4 мм фиксируют от 2 до 3—4ч, а затем переносят в 100 спирт.

Жидкость Боуэна. Смесь готовят из насыщенного раствора пикриновой кислоты (15 частей), 40 % раствора формальдеги (5 частей) ледяной уксусной кислоты (1 часть). Жидкость быстро проникает в фиксируемые об'ьекты, визивая незначительное сморщивание соединительной ткани. Фиксацию проводят в течение 1 сут, затем кусочки тщательно промывают в проточной воде (не менее 24 ч) й проводят через спирты возрастающей концентрации, которые повторно меняют, чтобы, по возможности, устранить желтую окраску ткани.

Смесь сулемы с формалином. Эту фиксирующую смесь готовят из 9 частей насыщенного водного раствора сулемы 1 части 40 % формальдегида. Смесь считается очень хорошим фиксатором для органов, богатых соединительной тканью. Продолжительность фиксации в жидкостях 2—24 ч. При фиксации в жидкостях, содержащих сулему, в препаратах обычно образуются кристаллические или аморфные преципитаты. Для их удаления к 70—80 % спирту, служащему для промывания кусочков сразу же после фиксации, добавляют несколько капель 3 % спиртового раствора йодата калия. Материал выдерживают в зтом растворе 24 ч — ткань должна приобрести коричневый оттенок. Если кусочки обесцвечиваются, нужно увеличить в растворе концентрацию йода. Затем из материала удаляют йод при помощи 0,25 % раствора тиосульфата натрия й промывают в дистиллированной воде.

Фиксирующая смесь «Суза» по Гейденгайну. Вначале 4,5 г сулемы й 0,5 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 80 мл дистиллированной воды, затем к раствору добавляют 2 г трихлоруксусной кислоты, 4 мл ледяной уксусной кислотьт й 20 мл 40 % формальдегида. Это одна из лучших фиксирующих смесей, одновременно обладающая декальцинирующим зффектом. Кусочки костной ткани, фиксируемой в смеси «Суза», должны быть не более 1 см. Фиксация продолжается от 3 до 24 ч в зависимости от величини исследуемого материала. Промывают материал в 96 % или 100 % спирте. Применение спирта меньшей концентрации нежелательно, так как при атом возможно чрезмерное набухание соединительной ткани. Далее кусочки обрабатывают в спиртовом йодо-йодокалиевом растворе.

Фиксирующая смесь «Супиформейс» по Пфулю. Смесь состоит из 40 мл концентрированного водного раствора сулемы, 20 мл 40 % формальдегида, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 40 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Зта смесь обладает очень хорошими фиксирующими свойствами, применение ее не вызывает сморщивания исследуемого материала. Продолжительность фиксации кусочков костной ткани 12—24 ч. Затем следуют промвание в 80 % спирте и обработка в спиртовом йодо-йодокалиевом растворе.

Жидкость Гелли (ценкер-формол). Непосредственно перед применением к исходному раствору Ценкера вместо ледяной уксусной кислоты добавляют 5 мл формалина. Кусочки костной гкани фиксируют от нескольких до 24 ч, затем промывают в проточной воде в течение 24 ч.

Фиксирующая смесь «Саномия». Смесь состоит из 3 г сульфосалициловой кислоты, 5 мл ледяной уксусной кислоты й 100 мл 100 % спирта. Является очень хорошим общим фиксатозом, не вызывающим сморщивание материала. Смесь приготавливают непосредственно перед использованием. Фиксацию небходимо проводить в темноте в течение 3—12 ч, материал промывают в 100 % спирте.

ДЕКАЛЬЦИНАЦИЯ КОСТНОГО МАТЕРИАЛА

В период становлення гистологической техники для демонстрации применяли шлифованные распилы кости. Однако зтот метод оказался малопригодным для гистологических исследований, так как в зтих очень толстых срезах была плохо различима структура костной ткани й при шлифовапии разрушались клеточные элементы. Для получения гистологических срезов костной ткани необходимо растворить соли кальция, т.е. декальцинировать материал, сохранив клеточнь злемент й органический матрикс кости.

Декальцинацию проводят после полной фиксации ткани, обычно в некислых фиксаторах. После декальцинации в кислотах необходимо проводить деацидификацию с помощью щелочных растворов или по крайней мере путем промывания в двух сменах спнрта. Нельзя допускать длительного промывания в проточной воде, так как зто способствует набуханню коллагеновых волокон, особенно если промывание проводится сразу после обработки в кислых растворах.

При проведений декальцинации надо учитывать следующие положення.

1. Продолжительность декальцинации в кислотах должна быть по возможности уменьшена, так как при длительном воздействни кислоты ухудшается способность тканей окрашиваться. В связи зтим декальцинации подвергают небольшие й тонкие кусочки костной ткани (толщиной 0,5— 1 см).
2. С целью уменьшения продолжительности декальцинаци необходимо брать большое количество декальцинирующей жид кости (ее обьем должен в 25—50 раз превосходить объем всех вместе взятых декальцинируемых кусочков костной ткани), чаще менять ее (каждые 24—48 ч) и встряхивать сосуд, в котором протекает реакция.
3. Продолжительность декальцинации не может быть установлена заранее, так как содержание солей кальция в декальцинируемой ткани может колебаться в очень широких пределах. Критерии окончания декальцинации — см. ниже.
4. Если декальцинацию проводили с помощью трихлоуксусной й пикриновой кислот, то кусочки промывают 80—90 % спиртом, после декальцинации неорганическими кислотами их промывают водой. В последнем случае во избежание набухання соединительной ткани перед промыванием обьект необходимо на 24 ч поместить в жидкость, уменьшающую набухание, например в 5 % раствор алюмокалиевых квасцов. Затем следует тщательно промыть материал в проточной воде в течение 24—48 ч.
5. Если декальцинируемая ткань содержит много жира (костный мозг), то ее необходимо предварительно обезжирить выдерживая обьект несколько дней в 96 % й 100 % спиртах, лучше в термостате при 37 °С.
6. 06'ьекты небольших размеров или такие, в которых костная ткань имеет тонкую структуру, можно предварительно залить в целлоидин.
7. Процесе декальцинации протекает быстрее в термостате при 37 °С, однако кислотная дскальцинация в зтих условиях обычно сопровождается возникновением различных артефактов.
8. После декальцинации кусочки кости можно резать на замораживающем микротоме или залить- -в парафин или целлоидин.

В зависимости от используемых реагентов различают кислотную и бескислотную декальцинацию.

Кислотная декальцинация

Минеральный компонент костной ткани в основном представлен кристаллами нерастворимого гидроксиапатита. С тем чтобы удалить зто вещсство из кости, его псрсводят в растворимое состояние в декальцинирующих растворах, обладающих высокой кислотностью. Используются азотная, сернистая, муравьиная, трихлоруксусная, пикриновая кислоты й жидкости различного состана.

Азотная кислота. Для декальцинации применяют 5—7,5% водный раствор азотной кислоты. Для его приготовления в мензурку с притертой пробкой наливают 5—7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и добавляют до 100 мл дистиллированную воду. В оптимальных условиях небольшие кусочки самой плотной кости декальцннируются в растворе азотной кислоты уже через 10 ч. После декальцинации для подавления набухання соединительной ткани кусочки кости на 24 ч иодвешивают в 5 % растворе сульфата натрия или лития й лишь после зтого промывают в течение 24— 48 ч в проточной воде.

Не рекомендуется применять растворы азотной кислоты как более низкой, так н более высокой концентрации: в нервом случае происходит пабухание, во втором — повреждение клсточных структур. При этом в более концентрированном растворе кислоты  значнтельно усиливается ее декальценирующее действие.

Сернистая кислота. Под воздействием сернистой кислоты нерастворимый в воде третичный фосфат кальция переходит в легко растворяющийся в воде первичный фосфат кальция. Для декальцчиации нспользуют насыщенный 5 % водный раствор серлисгой кислоты. Предварительную фиксацию кусочков кости лучше проводить формалином, а не растворами, содержащими сулему. Сернистая кислота обеспечивает быструю й рав-номерную декальцинацию в течение 5—8 дней.

Муравьиная кислота. Для декальцинации применяют концентрированную муравьиную кислоту, разбавленную равным количеством 70 % спирта или 10,-- 15 % раствором формалина.

Материал перед зтим должен быть хорошо фиксирован в фор-малине. После декальцинации, кусочки кости промывают в те-чение нескольких дней в часто сменяемом 70 % спирте или 10— 15 % растворе формалина, что позволяет избежать сильного на-бухания тканей. Муравьиную кислоту особенно рекомендуют использовать для декальцинации зубов. Она мало влияет на окрашиваемость срезов костной ткани.

Трихлоруксусная кислота. Обычно применяют 5— 10 % вод-ный раствор этой кислоты, который одновременно фиксирует материал. К зтому раствору целесообразно добавлять 10—20 % раствор формалина. Декальцинацию в трихлоруксусной кнслоте рекомендуется проводить после предварительной фиксации в формалине, жидкости Боуэна. Для декальцинации небольших кусочков достаточно 1—4 дней. Материал промывают в 96 % спирте в течение 3—4 дней при ежедневной его смене. Для промывания ни в коем случае нельзя использовать воду, что приво-дит к очень сильному набуханню соединительной ткани.

Пикриновая кислота. Концентрированный водный раствор кислоты применяют для декальцинации змбриональных обьек-тов й костей мелких животных, поскольку процесе декальцинации в ней проходит очень медленно (от одного до нескольких месяцев). Материал промывают в 70—80 % спирте во избежа-ние набухання соединительной ткани, а также потому, что обра-зующиеся под воздействием пикриновой кислоты осадки боль-шей частью нерастворимы в воде. Клеточные структуры тканий способность окрашиваться сохраняются очень хорошо.

Жидкость Виленсона (кислотно-формалино-солевой раствор). Эта жидкость состоит из 10 % раствора азотной кислоты, приготовленного на 5 % формалине с добавлением ацетата калия из расчета 5 г на каждые 100 мл декальцинирующего раствора. Продолжительность декальцинацни в зтом растворе зна-чительно мепьше, чем в других реагентах, при зтом способность тканей окрашиваться не ухудшается.

Жидкость ван-Эбнера. Она имеет следующий состав: 10— 15 г хлорида натрпя, 2 мл соляной кислоты (плотность 1,19) й 100 мл дистиллированной воды. Декальцинирующее действие оказывает соляная кислота. Хлорид натрия главным образом противодействует разбуханию коллагеновых волокон. Кусочки кости оставляют в этой жидкости на несколько недель й даже месяцев, в течение которых нужно ежедневно добавлять 1-2 мл соляной кислоты для сохранения первоначальной концент-рации или ежедневно менять декальцинирующую жидкость. По окончании декальцинации кусочки промывают в проточной воде, затем переносят для нейтрализации в ежедневно сменяеымый 10—15 % раствор хлорида натрия.

Жидкость Рихмана—Гельфанда—Хилла. Данную смесь готовят из следующих компонентов: 90 % муравьиной кислоты (100 мл), 38,8 % соляной кислоты (плотность 1,19—80 мл), дистиллированной воды (820 мл). Кусочки костной ткани декальцинируют в этой смеси 1—5 дней при 20 °С й за 6—24 ч при 37 °С.

Жидкость Гудинга—Стеварта. Зта смесь состоит из 25 мл коннцентрированной муравьиной кислоты, 75 мл дистиллированой воды й 5 мл 40 % формальдегида. Декальцинация в этой смеси продолжается от 1 до 7 сут.

Флороглуциназотная кислота. Зта жидкость позволяет проводить быструю декальцинацию — в течение нескольких часов. Однако для тонких гистологических исследований предпочтительнее декальцинация в жидкости Гудинга—Стеварта. Кусочки костной ткани помещают в большой обьем декальцинирующей жидкости, которую готовят следующим образом: в фарфоровой чашке к 1 г флороглуцина медленно добавляют 10 мл концентрированной азотной кислоти. После прекращения кипения в чашку добавляют еще 100 мл 10 % азотной кислоти. Первоначально декальцинирующая жидкость имеет темно-красный цвет, но через несколько дней после приготовления становится желтой, что не свидетельствует о снижении ее зффективности. Флороглуцин защищает ткань от набухання й мацерации, которые наблюдаются при действии кислот.

Жидкость Дженкинса. Смесь состоит из 4 мл концентрированной соляной кнслоты,, 3 мл ледяной уксусной кислоты, 1 мл дистиллированной воды, 73 мл 100 % спирта й 10 мл хлороформа. Кусочки костной ткани декальцинируют в зтом растворе 2—4 сут при 20 °С. После декальцинации материал промывают в двух сменах 100 % спирта по 4 ч в каждой. Перед заливкой в парафин или целлоидин спирт удаляют в двух сменах хлороформа по 3 мин в каждой. После декальцинации в этом растворе не происходит набухання коллагеновых волокон, срезы костной ткани хорошо окрашиваются.

При проведений декальцинации в кислотных растворах крышку

банки, в которой находится декальцинирующая жидкость, необходимо держать слегка приоткрытой, что способствует улетучиванию углекислого газа. Удалять образцы из кислотных растворов необходимо сразу после прекращения формирования в жидкости пузырьков углекислоты. Чрезмерно длительное пребывание образцов костной ткани в кислотных растворах нежелательно, так как при атом ухудшается качество окраски срезов.

Бескислотная декальцинация

Бескислотные методы декальцинации возникли как альтернатива кислотной декальцинации, которая имеет ряд недостатков: повреждающее действие кислотных растворов на клеточные структуры, особенно при передержке в них материала; набухание межклеточного матрикса, в частности коллагеновых волокон; инактивация многих ферментов, в связи с чем почти невозможно проводить гистохимические и гистознзиматические исследования.

Бескислотная декальцинация солями зтилендиаминотетрауксусной кислоты -ЭДТА

Бескислотная декальцинация рекомендуется в случае необходимости проведення гистохимических исследований костных образцов. эДТА й ее натриевые соли (версен, секвестрен, трилон Б, комплексон-ІІІ й др.) относятся к хелатообразующим агентам й имеют замечательное свойство: их растворм в комбинации с ионами кальция формируют легко растворимые отрицательио заряженнЫе комплексы кальция. При декальцинации в растворах эДТА не образуются пузыри газа, вследствие чего не по-вреждаются ткани. Использование эДТА й ее солей предотвращает нарушение окрашивания срезов декальцинированных костных образцов.

ЭДТА й ее соли рекомендуют использовать для декальцинации зубов й костей. Они с успехом могут быть применены для изучения щелочной фосфатазы й других ферментов (которые разрушаются в кислой среде при декальцинации), так как ЗДТА можно использовать при нейтральном рН.

ЗДТА й ее соли обычно используют в виде 5— 10 % водного раствора. Декальцинация проходит быстрее при ежедневной смене раствора. Щелочные растворы в некоторой степени гидролизуют белки, позтому рекомендуется применять растворы ЗДТА й ее солей в пределах рН 6,5—7,5. Губчатая кость в зтих растворах декальцинируется в течение 3—7 сут, компактная кость — намного дольше. На 1 г ткани необходимо брать приблизительно 100 мл декальцинирующей жидкости. После декальцинации кусочки тщательно промывают в проточной воде. Завершенность декальцинации чаще всего оценивают с помощью иголочного теста.

Приводим несколько известных методов бескислотной декальцинации хелатообразующими агентами.

Декальцинация версеном по Хиллеману—Ли. Смесь состоит из 5,5 % раствора версена, приготовленного на 10 % растворе формалина. Перед декальцинацией образцы в течение 24 ч фиксируют в нейтральном формалине. Декальцинирующий раствор обновляют каждые 10 сут. По наблюдению авторов, декальцинация большеберцовой кости крысы занимает в среднем 4 нед.

Декальцинация ЗДТА по Фрейману. Декальцинирующая жидкость представляет собой 5 % водный раствор ЗДТА, рН которого доведен с помощью гидроксида натрия до 6,0—6,5. Материал фиксируют в 80 % спирте в течение 24 ч при 4 °С, затем промывают проточной водой. Декальцинацию в первые 24 ч проводят при 4 °С, затем раствор заменяют й декальцинация продолжается при комнатной температуре в течение 2—21 сут. Раствор рекомендуют менять через равные промежутки времени.

Декальцинация трилоном Б. Декальцинирующий раствор состоит из 250 г трилона Б, 50 мл 40 % раствора гидроксида натрия й 1000 мл дистиллированной воды. В процессе приготовления раствора соблюдают следующую последовательность: 250 г трилона Б высыпают в огнеупорную стеклянную колбу, добавляют 200 мл дистиллированной воды, ставят колбу на пламя газовой горелки, добавляют 50 мл 40 % раствора гидроксила натрия, тщательно размешивают. Затем, не прекращая размешивания, добавляют 750—800 мл дистиллированной воды. С помощью 40 % раствора гидроксида натрия доводят рН до 7,4. Подогревание прекращают после полного растворения трилона Б. Повторно измеряют рН, добавляя при необходимости 40 % раствор гидроксида натрия.

Декальцинацию нежных образцов ткани, таких как улитка костного лабиринта пирамиды височной кости, желательно проводить после их заливки в целлоидин. Целлоидиновые блоки помещают в 3—5 % раствор азотной кислоты. После завершения декальцинации образцы в течение 24 ч обрабатывают 5 % водним раствором сульфата лития или натрия. Затем материал в течение 24 ч промывают в проточной воде с последующим обезвоживанием в спирте восходящих концентраций.

Критериями хорошей декальцинации костной ткани являются: 1) полное удаление солей кальция; 2) отсутствие в изучаемых срезах признаков разрушеиия клеток й соединительнотканных волокон; 3) отсутствие отрицательного влияния декальцинации на процессы окрашивания срезов костной ткани.

Факторы, влияющие на продолжительность декальцинации

На продолжительность действия декальцинирующих растворов .влияют несколько факторов. Два из них являются бесспорными и важными: 1) концентрация й пригодность активного агента;

2) температура, при которой протекает процесе декальцинации.

Концентрация активного агента. Применение различнх добавок, особенно буферов, защищающих ткани от повреждения, приводит к увеличению продолжительности декальцинации. В пределах определеннх ограничений более концентрированные растворы реагентов (особенно водные растворы кислот) действуют быстрее, но более вредны для обрабатываемых тканей. Известно, что в 4 н. растворе муравьиной кислоты декальцинация происходит вдвоє быстрее, чем в ином растворе, но 1 н. растворы соляной й трихлоруксусной кислот более зффективны, чем 4 н. Установление оптимальной концентраций активных реагентов является компромиссом, позволяющим добиться баланса между желаемым результатом декальцинации й нежелательным повреждающим действием на ткани.

Во всех случаях необходимо исключить значительное истощение активного декальцинирующего агента при его взаимодействии с кальцием. Позтому важно, чтобы соотношение обьемов

декальцинирующей жидкости-и обрабатываемой ткани было не менее чем 20:1, причем жидкость необходимо периодически менять. Некоторые авторы рекомендуют другое соотношение -100 мл реагента на 1 г ткани при необязательной смене декальцинирующей жидкости. Но некоторое истощение декальцинирующей жидкости тем не менее происходит, поэтому следует проводить смену сильных кислот 2—3 раза в течение 24 ч, сла-бых кислот   ежедневно, а ЭДТА — 1 раз в неделю.

Температура. При увеличении температуры ускоряются многие химические реакции, включая декальцинацию костного материала, но при зтом усиливается воздействие кислот на обрабатываемую ткань. Так, при температуре 60 °С кость может полностью мацерироваться почти так же быстро, как декальцинироваться.

Оптимальная температура для кислотной декальцинации не установлена. Однако в большинстве случаев декальцинацию проводят при температуре рабочей лаборатории, хотя некоторые автори предлагают считать стандартной температуру 25 °С. В то же время при низкой температуре реакции замедляются, в связи с чем материал, декальцинируемый в конце рабочей недели, можно оставить в кислоте при 4 °С на 2—3 дня. Особенно зто полезно при использовании муравьиной кислоты.

Увеличение температуры также ускоряет декальцинацию, проводимую с помощью ЗДТА, но без риска мацерации. Обычно не определяются повреждения материала, декальцинированного с помощью ЗДТА при 60 °С при условии, что ткань была хорошо фиксирована.

Размешивание декальцинирующей жидкости. Вопрос о влиянии размешивания декальцинирующей жидкости на декальцинацию костной ткани спорные. В проведенных исследованиях не удалось подтвердить влияние зтого фактора на продолжительность декальцинации костной ткани. Вместе с тем большинство авторов рекомендуют перемешивать декальцинирующий раствор 1—2 раза в день.

Подвешивание декальцинируемого материала. Декальцинирующая жидкость должна свободно соприкасаться со всеми поверхностями ткани. Дно посуды, в которой находится декальцинирующий раствор, обычно покрывают стеклянной ватой или любым другим инертным абсорбирующим материалом. Кусочки ткани подвешивают на нитке, что обеспечивает смачивание обьекта декальцинирующей жидкостью со всех сторон. Желательно выполнять зту процедуру, так как даже при небольшом количестве образцов может стать невозможным проход между  ними декальцинирующей жидкости, в результате чего увеличится продолжительность декальцинации.

Ионообменные смолы. L.W.DOTTI и соавт. (1951) описали метод использования ионообменных смол для ускорения декальцинации костной ткани, основаними на удалении из раствора

 свободного кальция. Результаты сравнивались с данными, полученными при использовании 13 % раствора цитрата натрия в 45 % муравьиной кислоте. Установлено, что декальцинация с юмощью ионообменной смолы происходит быстрее, чем в контроле. При атом обеспечивается высокая сохранность ткани й клеточных деталей (кроме случаев, когда концентрация муравьиной кислоты превышала 50 %). Однако ^.М. іпуоосі (1958) не обнаружил каких-либо различий в длительности декальцинации или сохранности ткани при сравнении действия кислот эквивалентных концентраций с добавлением й без. добавлення ионнобменной смолы.

Злектролиз. С целью ускорения декальцинации І.М. КісЬ-пап й соавт. (1947) разработали электролитический метод. При том кость прикрепляют к аноду, злектрический ток, проходя через раствор злектролита, способствует миграции ионов кальция к катоду й тем самым вызывает деминерализацию кости. В качестве электролитов были испытаны разные растворы. Наиболее зффективной сказалась смесь 8 % соляной й 10 % муравьиной кислот (они сами по себе обладают выраженным десальцинирующим свойством), декальцинирующая костные образцы в течение 2—6 ч. Декальцинацию проводили при температуре от ЗО до 45 °С, но на аноде она была определенно выше.

Другие авторы, используя подобную аппаратуру й схожие растворы, обнаружили, что продолжительность декальцинации костных образцов составляет 15—20 ч. Более того, Е.С. Сіау-Іеп (1952) показал, что злектролитический метод пособствует незначительному ускорению декальцинации. Существенным недостатком этого метода декальцинации является риск повреждения (ожог, набухание или гидролиз) или деструкции ткани при ее контакте с электродом.

Ультразвук. Е.З. ТЬогре й соавт. (1963) предложили использовать для декальцинации кости ультразвуковой генератор. Они сообщили о десятикратном увеличении скорости декальцинации ) без ущерба для структуры ткани й ее окраски в результате применения генератора с частотой 10,25 кГц й 7,5 % раствора уксусной кислоты. Однако другим авторам, повторившим подобные зксперименты, не удалось подтвердить зти данные. В среде, подвергаощейся воздействию ультразвука, температура повышается до )6 °С, что, вероятно, является единственным фактором, ускоряющим процесс декальцинации [Ра§е К.М., 1977]. Кроме того, ультразвук дает деструктивцый зффект й вряд ли может быть широко Использован как метод декальцинации.     .

Завершение декальцинации

При наиболее оптимальном варианте ткань необходимо извлекать из декальцинирующей жидкости немедленно после того, как из кости удалены последние следы минералов. Для этого необходимо постоянно наблюдать за ходом декальцинации. В отдельных случаях допускается некоторая передекальцина-ция материала. При атом материал окрашивают так же, как й костный образец, в котором сохраняются последние остатки ми-нералов.

Контроль за ходом декальцинации осуществляют в сочета-нии с заменой декальцинирующей жидкости. При использова-нии в качестве декальцинаторов слабых кислот тестирование на завершение декальцинации обычно проводят ежедневно, при проведений декальцинации с помощью ЗДТА — еженедельно. Тестирование образцов костной ткани с небольшим содержани-ем минералов, декальцинацию которых осуществляют с помо­щью сильных кислот, проводится однократно для оценки пол-ной декальцинации материала. В тех случаях, когда обработку материала осуществляют в условиях значительного дефицита времени, допускается его неполная декальцинация.

Для контроля за завершением декальцинации используют различные тесты. Наиболее простыми являются сгибание или сжимание кусочков пальцами, пробный надрез, прокалывание кусочка препаровальной иглой. Для выполнения зтих тестов требу ется большой практический опыт, й ни один из них не может быть признан удовлетворительным, так как возможно повреждение материала, в частности при прокалывании кусоч­ков иглой [Виноградова Т.П., 1964].

Химические тесты основаны на определении содержания кальция в декальцинирующей жидкости. Кальций-оксалатный метод позволяет обнаруживать в ней кальций за счет преципи-тации нерастворимых гидроокиси й оксалата кальция. Для про­ведення зтого теста берут приблизительно 3 мл использованной декальцинирующей жидкости, опускают в нее маленький кусо-чек лакмусовой бумаги й добавляют по каплям концентрирован-ный аммоний до тех пор, пока раствор не станет нейтральним (взбалтывают после добавлення каждой капли). Затем добавля­ют примерно 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония, хо-рошо взбалтывают й оставляют на ЗО мин.

Образование преципитата после добавлення оксалата аммо­ния свидетельствует о том, что в декальцинирующей жидкости имеется значительное количество кальция. Преципитация, по-ступающая после добавлення оксалата аммония, также позволя­ет сделать вывод о наличии кальция в декальцинирующей жид­кости, но в меньшем количестве. Если исследуемая жидкость остается прозрачной в течение ЗО мин, то ато означает, что де­кальцинация завершена.

Зтот метод не применяют в тех случаях, когда декальцинирую-щая жидкость содержит свыше 10 % кислот. Однако такая жид­кость может быть разведена или ее рН увеличен до 4,5 посредством добавления раствора гидроксида натрия непосредственно перед началом выполнения теста, но при зтом снижается чувствительность теста. Растворы муравьиной кислоты, концентрация которых выше 10 %, имеют тенденцию становиться мутными при проведений теста й обычно маскируют его результаты.

Процесе декальцинации кислотними жидкостями сопровожда-ется образованием диоксида углерода, покрывающим поверх-ность ткани слоем пузырьков. Они рассеиваются при встряхива-нии й образуются вновь до тех пор, пока в ткани присутствует карбонат кальция. Предлагалось использовать зтот показатель для оценки степени декальцинации, однако карбонат кальция со-ставляет только 4—5 % от общего количества всех минералов кости, позтому прекращение образования пузырьков углекислого газа не может быть надежным признаком полной декальцинации.

Несомненно, наиболее эффективным методом обнаружения кальция в ткани является рентгенография. С помощью стандартной клинической рентгенологической установки можно одномоментно исследовать несколько образцов.

Подрезание декальцинированного материала

Особым (завершающим) зтапом декальцинации является так называемое подрезание материала, т.е. окончательное моделирование кусочка кости перед его заливкой в избранную среду.

Необходимость в этом этапе бывает вызвана тем, что на поверхности кусочка кости (особенно губчатой) после пребывания его в кислотном декальцинаторе образуется слой (налет) жира костного мозга, содержащий костные крошки й нередко дере-вяшіые опилки. Налет жира удаляют, но при этом кусочек умсньшается в размерах, что нужно иметь в виду еще при выпи-лпвании образца. При работе с крупним фрагментом кости (из-готовление гистотопограмм) моделирование позволяет одновременно проверить полноту й качество декальцинации, избежать порчи микротомного ножа й получить качественные срезы. В случае неполной декальцинации ее приходится продолжить, таким образом, подрезание может быть неоднократным.

Проводят моделирование любым остро заточенным лезвием. Для этой цели пригодны скальпель, малый секционный нож, однако лучше использовать опасную бритву или лезвие безопасной бритвы, фиксированное в хирургическом иглодер-жателе. Опасная бритва имеет наиболее подходящий (не клиновидный, как у ножа или скальпеля) профиль й легко может бмть заточен на специальном мягком бруске или мелкозерни-стой наждачной бумаге. С помощью опасной бритвы можно по­мучить очень ровную поверхность, подлежащую резке на мик-ротоме, й не раскрошить при атом кость.

Следует заметить, что для качественного подрезания необхо-димо иметь используемый только для этой цели инструмент. ,Его нужно постоянно затачивать (особенно, если зто нож или |скальпель) й тщательно мыть после работы, так как металлическое лезвие портится от действия кислот при кислотной я кальцинации), следы которых сохраняются в кусочке кос) даже после тщательного промывания.

ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОБРАБОТКА МАТЕРИАЛА

В большинстве случаев в кусочках ткани, прошедших кислотную декальцинацию, всегда содержится то или иное количест кислоты. Перед переносом кусочков во вторичный фиксат или первую дегидратирующую жидкость остатки кислоти обычно удаляют путем быстрого ополаскивания в проточной во или с помощью промокання. После кислотной декальцинации целесообразнее использовать различные нейтрализующие ср( ства, включая промывание в проточной воде или других бол щелочных растворах, что предотвращает загрязнение дегид] тирующей жидкости. Перед дегидратацией также рекомендуется промывание материала в 2 сменах 70 % спирта в течение 12 18 ч.            .

Для получения замороженных срезов декальцинированную ткань предварительно промывают в воде или хранят в растворе формалина, что исключает коррозию металла, из которого изготовлен нож, под воздействием кислоты, которая обычно остается в ткани.

Декальцинированные в концентрированном нейтральном растворе ЗДТА ткани не помещают в 70 % зтиловый спирт, і как ато вызывает образование преципитатов в виде кристал, ческой корки из остатков ЗДТА й спирта. Для предотвращеі зтого дефекта Декальцинированные кусочки ткани после ЗІ на ночь помещают в раствор формалина.

При наличии не полностью обызвествленной ткани или в случаях, когда минеральные включення в ткани препятств получению удовлетворительных срезов, проводят поверхні ную декальцинацию. Минеральные включення выявляют по грубой (предварительной) резки ткани. В зтих случаях зали' в парафин кусочек обычно помещают на 15—60 мин в 1 % сс ную кислоту так, чтобы кислота соприкасалась только с той верхностью блока, которую предстоит резать. Поскольку г никновение кислоти внутрь образца незначительное, блок д жен быть тщательно ориентирован в микротоме во избежаї потери декальцинированных срезов.

ЗАЛИВКА ДЕКАЛЬЦИНИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА

Для приготовления гистологических препаратов декальцинированной костной ткани объект необходимо заключить в пластическую массу, способную полностью пропитать его и обеспечить консистенцию, позволяющую получать тонкие срезы. С этой целю используют заливку в парафин, целлоидин, целлоидин-парафин.

Заливка в парафин

Для маленьких кусочков декальцинированной костной ткани вполне пригодна обычная заливка в парафин по общепринятой методике. В качестве просветляющего агента используют хлоро-

)рм, который хорошо растворяет парафин (позтому его при-меняют как промежуточную среду между обезвоживанием й за-ливкой тканії). С целью более качественного пропитывания костной ткани парафином заливку желательно осуществлять в вакууме. Для зтого образцы костной ткани, лежащие в смеси парафина с воском (3:1), помещают в вакуумную камеру (ваку-мный термостат) при температуре 37 °С. Давление в вакуум­ні камере снижают очень медленно до 400—500 мм рт. ст. родолжительность парафиновой заливки в вакууме обычно со-лвляет /^~/1 времени, необходимого для заливки таких же ютных образцов при атмосферном давлений. В заключение процедуры давление в вакуумной камере медленно повышают до тех пор, пока оно не сравняется с атмосферним. Костные об-

іщы больших размеров вакуумируют 2—3 раза, каждый раз іюмещая их в новую порцию парафина. При вакуумной заливке значительно ускоряется замещение хлороформа парафином.

Т.П. Виноградова (1973) предложила метод ускоренной парафиновой заливки, используемый в отдельных случаях для материала, полученного при аспирации или пункции.

1. Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине 1— Зч.

2. В случае необходимости проводят декальцинацию от 1 — 2 ч до 1 сут с последующим промыванием.

3. Переносят в 95 % зтиловый спирт — 2 смены по ЗО мин.

4. Проводят через 100 % спирт — 2 смены по ЗО мин.

5. Помещают в бензол на ЗО мин.

6. Заливают в парафин при 52—58 °С на ЗО мин.

Метод двойной целлоидин-парафиновой заливки

Зтот метод обладает достоинствами парафиновой й целлоидино-вой заливок. В срезах образцов, залитых с помощью зтого метода, ткани различной плотности (кость, хрящ й прилежащие мягкие ткани) удерживаются вместе лучше, чем при заливке в парафин.

Методика заливки

і. Сухой целлоидин (10 г) растворяют в 1000 мл метилбензо-ла в закрытой колбе, которую необходимо встряхивать й пере-ворачивать 1—2 раза в день, 1—2 нед, иногда дольше.

2. Обезвоженные кусочки костной ткани помещают в полу-ченный раствор, который меняют через 24 или 48 ч, а при обра-ботке крупных обьектов — через 72 ч. В результате образцы становятся прозрачными.

3. Кусочки переносят в бензол (3 смены по 5—7 ч в каж-дой), после чего проводят по общепринятой методике через смесь, состоящую из равных частей бензол-парафина й чистого парафина.

Заливка в целлоидин

Целлоидиновая заливка незаменима при изготовлении гистоло-гических препаратов костной ткани. Целлоидин лучше связыва-ет друг с другом ткани разной консистенции, чем парафин, й предотвращает их разделение во время резки. Зтот способ за­ливки незаменим при получении гистологических срезов с боль-ших блоков кости (гистотопограмм) й кости с прилежащими мягкими тканями. В целлоидине кость становится более гибкой й близкой по плотности к заливочной среде. Корковое вещество кости меньше твердеет, чем при заливке в парафин. Для целло-идиновых срезов более пригодны некоторые методы окраски (например, метод выявления канальцев), кроме того, отдель-ные компоненты кости, такие как линии склеивания, выявляют-ся несколько лучше.

Целлоидиновая заливка имеет й недостатки. Так, из-за отно-сительно большой толщины получаемых срезов (10—20 мкм) затру днено изучение деталей клеток; возникают сложности при изготовлении больших й серийных срезов, их наклеивании на стекла; вследствие значительной продолжительности получения целлоидиновых срезов не всегда возможно их использование при исследованиях, проводимых с диагностической целью.

Заменителем целлоидина может быть ацетилцеллюлоза, по-лучаемая из негорючей кинопленки й рентгеновской пленки. Обработку й заливку кости в целлоидин проводят так же, как й мягких тканей, но заливочная среда должна быть более твер-дой. Некоторые исследователи предпочитают целлоидину низ-ковязкую нитроцеллюлозу, увеличивая тем самым твердость за­ливочной среды.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОТОПОГРАФИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

В практической й научной работе исследователей, специализи-рующихся в обпасти костной патологии, часто возникает необ-ходимость в сопоставлении тех или иных особенностей структу­ри костной ткани в отдаленных друг от друга участках. Зту возможность предоставляют гистотопографические (кристелле-ровские) обзорные препараты. С их помощью можно оценить распространенность й выраженность патологического процесса в пределах всего или большей части органа [Смольянников А. В., Саркисов Д.С., 1994], в связи с чем легче сопоставить патомор-фологические й клинические проявлення болезни.

Для приготовлений гистотопографических срезов вырезают сравнительно тонкие (0,7—1 см) пластинки кости. Их после-дующая обработка включает:

1. фиксацию в нейтральном формалине —4—6 сут;
2. декальцинацию —4—5 сут;
3. подрезание материала, обычно с последующей дофикса-цией в растворе формалина — 2 сут й дополнительной декальцинацией — 1—2 сут;
4. промывание в проточной воде   1 сут;
5. проводку по спиртам восходящей концентрации (70 %, %, 96%, 100%)— в каждом спирте не менее 3 сут;
6. проводку через смесь спирта с зфиром (1:1) — 3—5 сут. |ве смены жидкого целлоидина (в 1-й не менее 10 сут, во 2-й — не менее 5 сут), густой целлоидин — не менее 5 сут.

Пропитаними целлоидином материал наклеивают на боль-:ие деревянные блоки. Срезы готовят на санном микротоме, крашивают обычными способами.

ПОЛУЧЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ ДЕКАЛЬЦИНИРОВАННОЙ КОСТИ

Срезы с небольших кусочков декальцинированной костной ткани <ожно получить с помощью любого санного или ротационного икротома. Более крупные образцы, залитые в целлоидин, необ-здимо резать на санном микротоме. Для обработки больших й ііотных блоков используются микротомы специальной конструк-"ции. Применяют более толстые й жесткие микротомные ножи, от-носящиеся к группам В й С, имеющие размеры 240 х 36 х 13 мм. При зтом плосковогнутые ножи группы В чаще предназначены для резки обьектов, залитых в целлоидин, плоские ножи группы С - преимущественно в парафин [Меркулов Г.А., 1961].

Срезы недекальцинированной кости могут быть получены только с помощью специального обору дования. Однако в связи со значительными технологическими трудностями зтот метод нельзя рекомендовать для применения в повседневной практике.

Кусочки кости легче резать вдоль структури ткани. В некоторых случаях процесе получения срезов облегчается при ох-лаждении ткани. С этой целью к режущейся поверхности блока прикладывают на 5—7 мин кусочки льда.

Оптимальная толщина срезов костной ткани обычно немного больше, чем толщина срезов мягких тканей, й составляет 7 мкм. При охлаждении костной ткани льдом толщину срезов можно уменьшить до 5—6 мкм. Однако в таких срезах микроскопичес-ки часто определяются пустоты.

Даже при использовании совершенно чистих предметних стекол срезы кости плохо приклеиваются к ним, позтому стекла предварительно обрабатывают желатином, дихроматом калия или амилопектином.

Большинство срезов хорошо обработанной ткани, нареза ных острым ножом, выравнивают й высушивают без специал ной обработки. В отдельных случаях вследствие разной степеї -расширения парафина й залитой в него костной или хрящеві ткани плавающие на поверхности воды срезы могут образові вать складки. Срезы можно расправить путем повышения те;

пературы, но не выше точки плавлення парафина.

ОКРАШИВАНИЕ СРЕЗОВ ДЕКАЛЬЦИНИРОВАННОЙ КОСТИ

Для окрашивания срезов декальцинированной костной ткаї-применимо большинство методик окраски срезов мягких тк цей. Несколько ограничено использование некоторых красит лей лишь при кислотной декальцинации.

Окраска гематоксилином й зозином

Для окрашивания декальцинированной ткани можно использ< вать стандартную методику. Ткани, длительное время находи] шиеся в кислотном декальцинирующем растворе, окрашивают течение нескольких часов или даже подвергают ночной инкуб;

ции в стандартном растворе гематоксилина, разведенном дис тиллированной водой (1:10), с последующей окраской 0,1-] 0,5 % раствором зозина как обычно. Концентрацию красителе:

й продолжительность окрашивания можно изменять в завпед мости от степени воздействия кислоты на ткани.

Некоторые авторы отдают нредпочтение гематоксилину Зр лиха как более специфическому ядерному красителю, обладаю щему способностью выявлять хрящевые злементы (окрашива ются в голубой или пурпурный цвет), контрастирующие с кол лагеновой тканью (окрашивается в розовый цвет). С помощьв гематоксилина Зрлиха можно определять линии склеивания особенно при болезни Педжета, а также в кости, которая бы стро образуется или ремоделируется. Зта особенность менее вы ражена после кислотной декальцинации, но может быть усилені с помощью пролонгированного окрашивания. Линии склеива ния зрелой кости хорошо видны в срезах залитой в нитроцел люлозу декальцинированной кости, обработанной ЗДТА й он рашенной гематоксилином Зрлиха. Недостатком данной окрас' ки является нечеткость деталей ядер, которые иногда бываюі тусклыми, особенно в хрящевой ткани, позтому целесообразне^ использовать квасцовый (кислый) гематоксилин Майера.

Окраска коллагеновых волокон                    |

Выявление зрелых й тонких незрелых коллагеновых волокон необходимо, в частности, при некоторых опухолях. С этой

целью целесообразнее применять трехцветные методы, особен-но при заливке материала в нитроцеллюлозу. В результате ок-рашивания зрелая костная ткань выглядит как поля голубого или зеленого й ярко-красного цвета. Неправильнеє окрашива-ние возможно вследствие неадекватного проникновения красок иреагентов внутрь срезов, а также в связи с нагреванием срезов для их расправления.

Окраска по Ван-Гизону пригодна для выявления микро-структурм костной ткани, особенно после заливки материала в нитроцеллюлозу. Однако при зтом тонкие волокна могут окра-шиваться в неопределенные цвета.

Импрегнация серебром является ценным методом распозна-вания опухолей кости й метастазов опухолей в кости. Ее ре­зультат не зависит от метода декальцинации. Особое внимание необходимо уделять прикреплению срезов к предметным стек­лам перед использованием раствора аммиачного серебра.

Окраска хрящевой ткани й кислых гликозаминогликанов

Злементы хряща хорошо выявляются с помощью метахроматич-ного окрашивания. Более точная идентификация кислых гли­козаминогликанов возможна с помощью 0,05 % раствора альци-анового голубого в ацетатном буфере (рН 5,8), дающего при до­бавлений хлорида магния 0,4—0,5 М. Метод специфичен для хрящевой ткани.                         '' .

ШИК-реакция может быть использована для выявления ново-образованной кости й обызвествляющегося хряща благодаря со-держанию в зтих тканях кислых гликозаминогликанов. Молодые остеобласты содержат гликоген, позтому являются ШИК-пози-тивными. Зта реакция особенно показана для выявления гликоге-на в некоторых первичных опухолях кости й муцина в метастазах иекоторых опухолей кости. Результаты ШИК-реакции не зависят от метода декальцинации, но следует избегать пролонгированной обработки костной ткани сильными кислотами.

Специальные методы окраски

Остеоциты й их лакуны достаточно велики для того, чтобы их можно было легко идентифицировать в большинстве препара-тов, включая парафиновые срезы декальцинированной кости, окрашенные гематоксилином й зозином. Тонкие канальцы, иду-щие в радиальном направлений, выявляются частично в тонких целлоидиновых срезах, окрашенных гематоксилином, или в де-кальцинированном материале, импрегнированном серебром.

Один из методов выявления костных канальцев — их запол-нение какой-либо субстанцией, которая приобретает темную ок-раску, контрастирующую со светлым или неокрашенным

фоном. К таким методам относится простой способ «воздуші ин-ьекции» [ОаіепЬу ].В., 1934]. Недекальцинированные ср^ высушивают й заливают в бальзам, который расплавляется і| нагревании, й при попадании воздуха внутрь костных кана цев они выявляются как черные нити на общем неокрашеш фоне.

Пикротиониновый метод Шморля [ЗсЬтогІ О., 1934] ос ван на отложении тионинового преципитата внутри лакун й і нальцев. При зтом рекомендуется использовать замороженні или нитроцеллюлозные срезы, поскольку в них канальцы ме< ше сморщиваются, чем в парафиновых, й преципитат крас лучше проникает внутрь образцов. Однако длительно хран] шиеся в зтиловом спирте нитроцеллюлозные срезы могут ок] шиваться неудовлетворительно.

О. ЗсЬтогІ (1934) применял насыщенный раствор тионв в 50 % зтнловом спирте. Другие авторы рекомендуют испо. зовать наполовину насыщенный водный раствор тионш О. ЗсЬтогІ считал предпочтительным щелочной раствор й }. бавлял непосредственно перед использованием 1—2 капли ко центрированного раствора аммиака на 10 мл раствора красиі ля. Позднее было установлено, что разные партии тионина ра личаются по пригодности для окрашивания зтим методом, п атому необходимо подбирать концентрацию аммиака (о] может доходить до 1 капли на 100 мл красящего раствора В практической работе вместо тионина может быть с успехс использован азур А. І

Фиксацию осуществляют с помощью любых фиксатороі кроме тех, которые содержат дихлорид ртути. Декальцинациі проводят в любом декальцинирующем растворе. Основним яе ляется 25 % водный раствор тионина, из которого готовят рабо чий раствор (отфильтрованный основной раствор, разведениьп зквивалентным обьемом дистиллированной воды с добавленис раствора аммиака непосредственно перед использованием).

Методика окраски

1. Срезы промывают дистиллированной водой 10 мин.
2. Окрашивают в рабочем растворе тионина 5—10 мин более.
3. Промывают дистиллированной водой.              
4. Обрабатывают насыщенным водным раствором пикриновой кислоты 30—60 с.
5. Промывают дистиллированной водой.
6. Дифференцируют в 70 % этиловом спирте до тех пор, поі перестанут образовываться голубовато-синие скопления красителя 5—10 мин или более.
7. Быстро обезвоживают, просветляют в ксилоле й заключают.

Срезы обрабатывают осторожно в 3-6 стадиях. Результат: лакуны и канальцы тёмные, костный матрикс желтый, клетки красные.