О методике изучения распределения микроэлементов в органах человека

В работах, проведенных за последнее время, установлены характерные закономерности по распределению микроэлементов в костях в зависимости от пола и возраста, давности захоронения; определенные накопления в легких живо- и мертворожденных младенцев: специфические загрязнения судебно-медицинских объектов, позволяющие дифференцировать повреждения различными предметами; перераспределение микроэлементов в мышцах в зависимости от давности смерти (В.М. Колосова; А.Ф. Рубежанский; И.Б. Дмитриев; Г.Н. Назаров; Е.В. Лосева; Г.А. Пашинян; А.П. Загрядская; В.А. Законов; В.В. Жаров, и др.). Однако данные, относящиеся к точному определению концентрации микроэлементов, топографии их распределения в различных органах, перераспределению при различных состояниях организма, разработаны недостаточно. Существенные недостатки имеются в работах, в которых определяется и используется в качестве контроля содержание микроэлементов в норме. За такую норму принимают концентрацию элементов во внутренних органах трупов людей, умерших внезапно от травм, асфиксии, отравления и пр. Как правило, изучают небольшую группу разнородных объектов без учета вида смерти, пола, возраста, заболевания, распределения элементов в различных отделах органа, используя различные методики исследования и т. д. Нечетко определено и понятие «нормы». Речь может идти только о физиологическом разбросе микроэлементов, который зависит от большого числа факторов (биогеохимической провинции, в которой жил человек, его питания, профессии, физического состояния и др.). Такой физиологический разброс присущ только изучаемой группе людей и не может быть использован как некая отвлеченная «норма» для различных исследований. Совершенно очевидно, что. для судебно-медицинских целей необходимо систематическое исследование органов и тканей людей, погибших от различных причин, изученных через определенное время после смерти, и т.п.

Специфичность судебно-медицинских исследований заключается в том, что к ним предъявляются строгие и весьма определенные требования. Они включают в себя выбор системы исследования, тщательность подбора объектов, объективность оценки сравниваемых данных и пр. В то же время судебно-медицинская практика позволяет осуществить целенаправленный выбор объектов, подбор их в коллекции с последующей статистической обработкой.

Мы исследовали физиологические колебания содержания микроэлементов в органах людей, умерших от черепно-мозговой травмы, которые в дальнейшем мы будем рассматривать как своеобразную норму. Мы надеемся, что по установленным статистическим характеристикам для исследованной группы будет оценена возможность выявления перераспределения элементов при различных состояниях организма, различных видах смерти и пр.

При осуществлении подобных работ большое значение приобретает выбор единой системы исследования при тщательном соблюдении всех условий эксперимента.

В качестве общей системы исследования мы остановились на методике определения относительных количественных соотношений микроэлементов с последующей статистической обработкой (система разработана в Научно-исследовательском институте судебной медицины для целей идентификации).

Исследовали органы и ткани лиц 20 — 40 лет, преимущественно мужчин, не страдавших хроническими и профессиональными заболеваниями, умерших сразу после травмы.

Исследовали кору левой лобной доли, продолговатый мозг, кору правого полушария мозжечка; участки мышцы сердца — переднюю и заднюю стенку левого и переднюю стенку правого желудочка, межжелудочковую перегородку; нижнюю долю левого легкого; левую долю печени; среднюю треть селезенки; корковое и мозговое вещество правой почки; нисходящую часть грудной аорты; гипофиз; правую долю щитовидной железы; правый надпочечник; правое яичко (яичник); кровь из правого сердца и др.

Исследованию подлежала собственно ткань органа. От каждого органа брали 10—15 г, удаляли оболочку, капсулу, различные включения (жир, крупные сосуды, бронхи и пр.), размельчали на кусочки толщиной 0, 2—0, 3 см и промывали дистиллированной водой для удаления крови (изъятие и обработку производили хромированными инструментами без следов заточки, ржавчины, зазубрин, с соблюдением правил подготовки объектов к спектральному анализу).

Перед промыванием объекты взвешивали. Отмытые объекты высушивали в фарфоровых тиглях в термостате при 60—65° до постоянного веса и хранили в пакетах из бумаги (кальки). Объекты, собранные в коллекцию (от всех исследуемых трупов), озоляли в муфельной печи при 380—400° в тиглях из кварцевого стекла.

Для определения времени озоления провели серию предварительных экспериментов — изучали влияние длительности озоления на вес объекта и интенсивность спектральных линий в пробе.

Например, вес коры лобной доли мозга после изъятия из трупа 42, 5 г, после высушивания — 9, 330 г. После озоления 1 г в течение 15 мин. вес объекта равнялся 0, 540 г, в течение 30 мин. — 0, 490 г, в течение 45 мин. — 0, 440 г, в течение 60 мин. — 0, 380 г, в течение 2 часов — 0, 330 г, в течение 3 часов — 0, 310 г, в течение 6 часов — 0, 300 г.

По этим данным строили кривую (рис. 1), показывающую концентрирование неорганической части объекта в зависимости от времени озоления. Анализ кривой, а также оценка спектров каждой пробы позволили прийти к выводу, что озоление (вернее обугливание) вещества коры лобной доли в течение 3 часов достаточно для получения интенсивных спектральных линий (пригодных для фотометрирования) всех исследуемых нами элементов и обеспечивает хорошую воспроизводимость данных.

Аналогичным способом установлено, что для каждого органа существует определенное, наиболее эффективное время озоления. Необходимо отметить, что мы прекращали озоление в тот момент, когда дальнейшее пребывание пробы в муфеле не изменяло веса более чем на 2—5%. Так, например, легкое обугливали 20 мин., аорту — 35 мин., печень — 40 мин., почку — 60 мин.

После обугливания объекты взвешивали и растирали в агатовой ступке до пудрообразного состояния. Предварительные эксперименты показали, что растирать следует особо тщательно, так как степень измельчения влияет на воспроизводимость результатов спектрографирования.

Объекты, подготовленные описанным способом, были готовы для спектрографирования.

Спектры фотографировали на спектрографе ИСП-28 с трехлинзовым освещением.

Источником света служила дуга переменного тока (генератор ДГ-2). Электроды — спектрально-чистые угольные стержни марки В-3. Верхний электрод затачивали на конус, в нижнем — высверливали кратер глубиной 5 мм. Съемку осуществляли через трехступенчатый ослабитель.

Перед серийным массовым исследованием проводили эксперименты для определения минимального количества объекта, позволяющего одним анализом определить 15—20 элементов, а также оптимальных условий режима съемки. Наиболее эффективны параметры эксперимента при навеске 30 мг, экспозиции 30 сек., силе тока 8 а, ширине щели спектрографа 0, 018 мм.

Рис. 1. Кривая зольности вещества коры лобной доли головного мозга.

Спектры фиксировали на спектральных фотопластинках типа II чувствительностью 16 ед., постоянно одной серии эмульсии. Проявляли в метол-гидрохиноновом проявителе в течение 4 мин.

На каждой пластинке, кроме спектра железа и 24 проб объектов, фиксировали эталон — специально подготовленную для этой цели высушенную, озоленную, тщательно растертую печень человека. В ней изучали те же количественные критерии (см. ниже), что и в различных анализируемых органах. Эталон служил для оценки эксперимента в целом, так как он являлся связующим звеном для всех серий исследованных объектов. Разброс отдельных признаков в эталоне свидетельствовал об ошибке эксперимента, влиянии на различные элементы и их воспроизводимость всех условий подготовки и проведения анализа.

Каждый объект спектрографировали 3 раза. Спектральные линии фотометрировали на микрофотометре МФ-2 (по шкале логарифмов) постоянно по одним и тем же ступеням спектрограмм (по трехступенчатому ослабителю). Для оценки мы избрали и фотометрировали спектральные линии элементов следующих длин волн: К — 4044,1 А (3-я ступень), Na — 3302,3 (3-я ступень), Cu — 3247,5 (3-я ступень), Са — 3158,9 (2-я ступень), А1 — 3082,2 (1-я ступень), Mg — 2802,7 (3-я ступень), Мn — 2801,0 (2-я ступень), Fe — 2599,3 (2-я ступень), Р — 2554,9 А (1-я ступень). Обозначения ступеней ослабителя соответствуют: 1-я ступень — 50%, 2-я ступень — 100% и 3-я ступень — 12,5% пропускания света.

Количественные характеристики определяли в виде коэффициентов отношений

K₁ = lg (I лин₁ / I фон₁₎ к K₂ = lg (I лин₂ / I фон₂₎

что можно использовать, как разности плотностей почернения спектральных линий, применяемые в общей спектроскопии.

Статистическая оценка выбранных количественных критериев — коэффициентов отношений спектральных линий К к Са, Na к Са, Cu к Са, А1 к Са, Mg к Са, Mn к Са, Fe к Са и Р к Са — заключалась в построении функции распределения для каждого соотношения, определения среднеарифметической коэффициента и средней квадратической ошибки (К±σm), ошибки для 2 сравниваемых рядов, разности показателей 2 рядов и коэффициента достоверности (t), который свидетельствует о существовании или отсутствии устойчивой статистической разницы между 2 совокупностями объектов по отдельным количественным критериям (Л.С. Каминский). Статистическую обработку изучаемых коэффициентов производили для выяснения физиологических колебаний анализируемых количественных критериев в отдельных органах, в различных отделах одного органа. При дальнейших сравнительных исследованиях, например, различных патологических состояний организма, эти коэффициенты статистически оценивают как дифференцирующие признаки.

Рис. 2. Кривая распределения объектов (№ 1) в зависимости от величины коэффициента Cu/Са.

Рис. 3. Кривая распределения объектов (№ 1 и 2) в зависимости от величины коэффициента Cu/Са. --- - объект №1; - - объект №2.

В качестве примера анализа и статистической обработки приводим исследование коры левой лобной доли головного мозга (объект №1) и продолговатого мозга (объект № 2).

В каждой совокупности исследовано по 50 объектов. После троекратной съемки объекта № 1 и фотометрирования спектральных линий среднеарифметические значения оказались равными: линии меди — 54,83 и линии кальция — 33,55. Коэффициент отношения Cu/Са равен 1, 64. Таким же образом получены коэффициенты отношения для каждого из 50 объектов. Совокупность их представлена следующим экспериментальным рядом: 1—1,76; 2—1,56; 3—2,1; 4—1,4; 5—1,33; 50—2,19.

Среднеарифметическое значение коэффициента для всей совокупности и значение среднего квадратического отклонения от среднеарифметической (К±σm) равны 1,68±0,08. По приведенным данным экспериментального ряда построена кривая распределения (рис. 2), показывающая частоту встречаемости выбранного количественного критерия. Кривая распределения дает возможность судить о физиологическом разбросе данного признака в изучаемой совокупности объектов. Ошибку эксперимента учитывали по эталону — она не превышала 5—7%.

Аналогичным способом исследовали объекты № 2. Среднеарифметическое значение коэффициента отношения линии меди к линии кальция и среднеквадратическое отклонение равны 1,28±0,09. Разность между среднеарифметическими 2 приведенных совокупностей — 0,40, ошибка разности ±0,12. Следовательно, коэффициент достоверности равен 3,3. Судя по нему, между 2 изучаемыми совокупностями существует устойчивое статистическое различие (t>3) по изученному признаку (К Cu/Са). Это позволяет сделать вывод, что содержание меди и кальция, а также их соотношение неодинаковы в коре левой лобной доли головного мозга и продолговатом мозге.

Построение функции распределения для 2 сравниваемых рядов приведены на рис. 3. Кривые распределения наглядно показывают, насколько велик физиологический разброс этих элементов, в каких пределах совпадают или не совпадают анализируемые признаки в 2 совокупностях.

Подобный анализ целесообразен для сравнения объектов, объединенных по ряду признаков — времени, прошедшему после наступления смерти, виду и типу смерти, различным патологическим состояниям организма и т. д. Изучение физиологического разброса содержания микроэлементов во внутренних органах человека, система спектрографического исследования с дальнейшей статистической оценкой полученных данных необходимы для получения надежных количественных идентификационных признаков с целью использования эмиссионного спектрального анализа при судебно-медицинской экспертизе трупов. Оценка полученных данных позволяет получить информацию о распределении микроэлементов в различных органах и тканях человека. С учетом этих результатов можно проводить целенаправленное определение абсолютных концентраций микроэлементов, наиболее характерно изменяющихся при различных патологических состояниях организма, видах смерти и иных процессах, имеющих судебно-медицинское значение.

Поступила в редакцию 26/XII 1966 г.