Сывороточная система Gc

В 1953 г. Grabar и Williams разработали иммуноэлектрофоретический анализ сыворотки, который нашел широкое применение в серологии. Этот анализ основан на использовании (в совокупности) электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности отдельных компонентов сложных белковых смесей. Такое использование позволяет различать белки, обладающие одинаковой электрофоретической подвижностью, но различающиеся по иммунологическим свойствам. Благодаря этому аналитические возможности иммуноэлектрофореза значительно шире, чем аналогичные возможности простого электрофореза.

Принцип метода состоит в следующем. Сначала сыворотку разделяют посредством электрофореза в геле, а затем в этот же гель в направлении, перпендикулярном оси миграции, диффундирует иммунная сыворотка, преципитирующая белок человека. При соединении преципитирующих антител иммунной сыворотки с антигенным комплексом испытываемой сыворотки, предварительно разделенной на отдельные электрофоретические фракции, образуются дуги преципитации. Каждый антиген реагирует только со своим гомологичным антителом и дает отдельную дугу. Реакция преципитации очень чувствительна, что позволяет обнаруживать компоненты, присутствующие в очень низкой концентрации. После промывания и высушивания дуги отчетливо проявляются при окрашивании различными красителями. Иммуноэлектрофоретический анализ позволил к настоящему времени выделить в нормальной сыворотке около 30 компонентов.

В 1959 г. Hirschfeld обнаружил методом иммуноэлектрофореза в зоне АЛЬФА₂-глобулинов между дугами альбумина и трансферрина компонент, обладающий определенными групповыми различиями, и назвал его Gc (groupspecific component). У одних людей он обладает большей электрофоретической подвижностью (Gc 1 — 1), у других — меньшей (Gc 2—2), у третьих занимает позицию обоих вышеназванных типов (Gc 2—1) — рис. 1. При смешении равных количеств сывороток групп Gc 1—1 и Gc 2—2 на иммунофореграммах образуется дуга преципитации, характерная для Gc 2—1. По данным Schultze с соавторами, изолировавших Gc-компонент в чистом виде, в состав его, помимо протеина (96%), входят гексоза (2%) и гексозамин (2%). Физиологическое значение Gc-компонента в организме неизвестно.

Marek с соавторами установили, что Gc-компонент разрушается при нагревании до 70° в течение 10 мин. Vogt, а также Heifer и Bolkenius выявляли Gc-фактор в соскобе из пятен крови с давностью хранения до 10 дней. В следах на всасывающем предмете-носителе определить Gc-группы оказалось практически невозможно. Nerstrom и Skafte Jensen установили Gc-кампонент в пятнах сыворотки с давностью хранения 1—2 месяца. Heifer и Bolkenius доказали, что Gc-группы можно определять и в жидкой крови, длительно хранившейся в холодильнике, а также в трупной крови. Gc-система независима от всех известных эритроцитных и сывороточных систем, в том числе и от групп гаптоглобинов, которые также относятся к АЛЬФА₂-глобулинам. При электрофорезе в крахмальном геле Gc-компонент выявляется в зоне постальбумина. По мнению Schultze и соавторов, а также Arfors и Beckman, выделенные ранее группы постальбумина идентичны группам Gc.

Рис. 1. Три Gc-типа при иммуноэлектрофорезе (схема по методу Гиршфельда).

Gc-группы генетически обусловлены. Это доказано многочисленными посемейными обследованиями. Генетические свойства их объясняются существованием пары аллельных кодоминантных генов Gc¹ и Gc². Фенотипы Gc 1—1 и Gc 2—2 гомозиготны и соответствуют генотипам Gc¹ Gc¹ и Gc² Gc², а фенотип Gc 2—1 гетерозиготен и определяется генотипом Gc² Gc¹. По правилам наследования менделевской доминанты у ребенка не может развиться Gc¹ или Gc², если его не было у обоих родителей; у родителей с противоположными гомозиготами ребенок должен быть гетерозиготным; если оба родителя или один из них обладает гомозиготным Gc-типом, то ребенок не может быть с противоположной гомозиготой (табл. 1). Наследственные свойства Gc-системы за рубежом нашли широкое применение в экспертизах по спорному отцовству, материнству и обмену детей. Шансы исключения отцовства непричастного мужчины только при применении Gc-системы составляют для европейских народов 15—17% (Marek и соавторы; Heifer, и др. ).

Gc-компонент у человека возникает уже в эмбриональный период развития. Marek и соавторы у новорожденных в 40% случаев устанавливали Gc-группу, отличавшуюся от группы материнской крови. Nertrom обнаруживал ее даже у 20-недельных плодов. Признаков трансплацентарного переноса Gc-фактора не выявлено.

Распределение Gc-групп и частота генов у некоторых европейских народов приведены в табл. 2. Частота гена Gc¹ для европейских популяций лежит в пределах 0, 680—0, 750, у негров она свыше 0, 800. У азиатских народов распределение Gc-групп очень различное, частота гена Gc¹ колеблется от 0, 640 до 0, 940 (Thomas и Hofmann). Holzhausen и соавторы, Heifer, Reinskou и др. определяли Gc-фактор в сыворотке при различных заболеваниях. Частота его в основном соответствовала распределению у здоровых людей; каких-либо затруднений определение Gc-компонента при этом не представляло.

Таблица 1

Наследование групповых факторов Gc

Родители	Возможные фенотипы у детей
1—1×1—1	1—1
1—1×2—1	1—1, 2—1
1—1×2—2	2—1
2—2×2—2	2-2
2—2×2—1	2—2, 2—1
2—1×2—1	2—2, 2—1, 1 —1

Таблица 2

Распределение Gc-групп и частота генов у европейских народов

Популяция	Коли­чество	Gcl —1	Gc2—1	Gc2—2	Частота генов		Автор
			(%)		Gc1	Gc2
Шведы	1 744	55,7	37,2	7,1	0,743	0,257	Hirschfeld
Датчане	1 312	52,90	39,25	7,85	0,725	0,275	Nerstrom
Норвежцы	383	52,74	38,91	8,35	0,722	0,278	Reinskou, Mohr
Англичане	49	48,98	44,90	6,12	0,714	0,286	Hirschfeld
Немцы (ГДР)	854	52,34	39,81	7,85	0,722	0,278	Schlesinger и соавторы
Немцы (ГДР)	1 068	46,5	43,7	9,8	0,684	0,316	Marek и соавторы
Немцы (ГДР)	736	56,11	37,77	6,12	0,750	0,250	Holzhausen и соавторы
Немцы (ФРГ)	805	54,29	38,88	6,83	0,737	0,263	Baitsch, Ritter
Немцы (ФРГ)	769	53,06	40,31	6,63	0,732	0,268	Wendt, Theile
Немцы (ФРГ)	2 248	51,96	40,04	8,00	0,720	0,280	Heifer
Швейцарцы	200	53,5	35,5	11,0	0,713	0,287	Hess, Butler
Австрийцы	1 000	51,4	41,5	7,1	0,721	0,279	Herbich
Чехи	228	46,5	43,9	9,6	0,684	0,316	Kofinek, Kout
Русские	630	50,64	39,52	9,84	0,704	0,296	Собственные исследования

Для установления Gc-компонента необходима пригодная гетероиммунная сыворотка, преципитирующая белок человека. При иммунизации кроликов, лошадей, коз человеческими сыворотками у животных образуются Gc-антитела. По данным Bundschuh и соавторов, пригодные для Gc-реакций антитела образуются у 40% иммунизированных кроликов. Не все лошади и козы, подвергшиеся иммунизации, могут давать анти-Gc-сыворотку. Значительно затрудняет дифференциацию Gc-групп наличие в АЛЬФА₂-глобулиновой области нескольких преципитационных дуг, перекрещивающихся между собой и маскирующих Gc-компонент. Нередко преципитат типов Gc2—1 и Gc2—2 перекрывается преципитатом гаптоглобина. Для лучшей диагностики Gc-групп Bundschuh и Krause разработали методику очищения Gc-антисывороток путем абсорбции термоинактивизированной человеческой сывороткой антител, затрудняющих обнаружение Gc-компонента. Для этого свежую человеческую сыворотку нагревают 30 мин. при 64°, замораживают 2—3 часа при —20°, после оттаивания и центрифугирования смешивают с Gc-антисывороткой в соотношении 1:2. Для абсорбции достаточно 20 мин., окружающая температура особого влияния на реакцию не оказывает. После абсорбции смесь центрифугируют и верхние прозрачные слои отделяют от осадка. В результате нагревания и последующего замораживания Gc-компонент и некоторые другие термолабильные белковые фракции разрушаются, однако большинство белков устойчиво к этим воздействиям. При абсорбции удаляются антитела, специфичные к сохранившимся белковым фракциям, но остаются Gc-антитела. Кроме Gc-компонента, на иммунофореграммах проявляются дуги АЛЬФА₂-макроглобулина и липопротеидов. Эти фракции, однако, не только не мешают определять Gc-разновидно-сти, но и способствуют лучшей ориентации.

Цель нашей работы — изучить распределение Gc-разновидностей и частоту генов у группы русского населения. В реакцию вводили иммунную лошадиную сыворотку анти-Gc, полученную в Берлинском институте судебной медицины университета им. Гумбольдта и очищенную по методу Bundschuh и Krause. Для изучения возможности использования в Gc-реакциях сывороток, выпускаемых Научно-исследовательским институтом судебной медицины Министерства здравоохранения СССР, преципитирующих белок человека, испытаны такие сыворотки нескольких серий.

Gc-фактор в нормальных сыворотках определяли по методике Hirschfeld в модификации Schlesinger, Vogt, Prokop.

Приготовление агарового геля

30 г сухого агара вымачивали в течение суток в 1 л дистиллированной воды, расплавляли в водяной бане, выливали в кювету и после застывания разрезали скальпелем на кубики размерами приблизительно 2X2X2 см, в течение недели промывали в ежедневно меняемой дистиллированной воде. 100—150 г отмытого агара расплавляли в водяной бане и смешивали с лактат-вероналовым буфером (pH 8, 6) и дистиллированной водой в соотношении 100:100:100 мл. Остальной 3% агар в кубиках сохраняли в дистиллированной воде. В состав лактат-вероналового буфера для приготовления агарового геля входят мединал (10,51). веронал (1,66), лактат кальция (1,53) и дистиллированная вода (до 1 л).

50 мл жидкого 1% агарового геля выливали на фотопластинку (13X18 см), установленную строго горизонтально. Для лучшего сцепления с гелем пластинку предварительно покрывали пленкой 3% агара. Для получения пленки отмытую и обезжиренную пластинку погружали в расплавленный 3% агар, высушивали (1—1,5 часа) при комнатной температуре и помещали на 30—60 мин. в сушильный шкаф при 180°.

Рис. 2. Определение Gc-типов (20 различных проб сывороток) на фотопластинке размером 13x18 см.

Вылитый на такую пластинку 1% агар затвердевал в течение 20—30 мин. Затем, положив пластинку на бумагу с нанесенным рисунком, в агаровом геле стеклянной глазной тонкостенной пипеткой прокалывали два вертикальных ряда отверстий диаметром 0, 15—0, 2 см (по 10 отверстий в каждом ряду). Водоструйным насосом отверстия очищали от агара. Два рядом лежавших отверстия удалены друг от друга на 1, 5 см (рис. 2). Пипетками Пастера отверстия доверху наполняли различными нормальными сыворотками, приготовленными для анализа (в каждое отверстие вмещалась лишь микрокапля сыворотки).

Электрофорез проводили в камере из плексигласа размером 26×26 см (высота стенок 5 см). Внутри камера перегорожена двумя параллельными сплошными стенками высотой 4,4 см, удаленными друг от друга на 15 см, а от боковых стенок — на 5,5 см. В боковые отделения камеры помещали электролит — лактат-вероналовый буфер для электрофореза (pH 8, 6) несколько иного состава, чем для геля: мединал — 8,76, веронал — 1,38, лактат кальция — 0,38, дистиллированная вода — до 1000 мл. В каждое отделение наливали по 500 мл буфера.

На края внутренних перегородок камеры помещали 2 пластинки с агаровым гелем, в отверстиях которого находились испытываемые сыворотки. Таким образом, одновременно можно было исследовать 40 проб сывороток. Агаровый гель с обеих сторон соединяли с буфером полосками фильтровальной бумаги, сложенной вдвое. Длина полоски равнялась ширине пластинки, ширина — 6 см. На края пластинки бумагу надвигали на ширину 1—1,5 см. Камеру ставили на выровненную горизонтальную поверхность. Электродами служила платиновая проволока.

Электрофорез длился 2—2,5 часа. Использовали выпрямитель переменного тока. Напряжение на электродах составляло 230 в, сила тока — 60 ма, а наиболее благоприятный градиент потенциала на пластинках — 6—7 в/см. При электрофорезе АЛЬФА-глобулины (в том числе и Gc-kom-понент) мигрируют от катода к аноду. Для предотвращения подсыхания геля камеру покрывали стеклом, которое в процессе электрофореза (в связи с запотеванием) несколько раз переворачивали. Одну порцию буферного раствора для электрофореза применяли не более 2 раз. Перед вторым электрофорезом катодный и анодный электролит смешивали.

Реакция преципитации и окраска

После окончания электрофореза в агаре между каждой парой отверстий скальпелем вырезали траншею длиной 4 см и шириной 0. 2 см. Правый конец ее находился на одной вертикальной линии с отверстиями. Траншею заполняли сывороткой анти-Gc. Для более равномерного диффундирования антисыворотки необходимо следить, чтобы стенки траншеи были ровными (без изгибов и комочков агара). Пластинку с агаровым гелем на 18—24 часа помещали во влажную камеру при 37° (влажной камерой служила покрытая стеклом пластмассовая кювета, на дне которой находилась пропитанная водой фильтровальная бумага). Антитела из стандартной сыворотки и находящиеся в геле антигены диффундируют навстречу друг другу и при встрече образуют преципитаты, располагающиеся в геле в виде дуг. Для лучшего выявления дуг производили окрашивание амидочерным.

Перед окраской пластинку с гелем в течение 12—18 часов промывали при комнатной температуре в одной порции физиологического раствора, а затем 4—5 часов — в дистиллированной воде. После этого пластинку, предварительно покрытую (для предотвращения растрескивания геля) листом мокрой фильтровальной бумаги, высушивали при комнатной температуре. С высушенной пластинки удаляли фильтровальную бумагу, а прилипшие остатки отмывали струей воды. Пластинку помещали на 10—15 мин. в раствор красителя. Избыток краски удаляли, погружая пластинку последовательно в две порции обесцвечивающего раствора.

Раствор красителя следующий: амидочерный — 1,0, метиловый или этиловый спирт 70°—700,0, дистиллированная вода — 200,0, кислота уксусная ледяная — 100, 0. В состав обесцвечивающего раствора входят метиловый или этиловый спирт 70°, дистиллированная вода и уксусная ледяная кислота (в тех же пропорциях, что и в растворе красителя).

Окрашенную пластинку обмывали струей воды. Результаты реакции учитывали при сильном рассеянном освещении. Источник света помещали сзади от пластинки.

После окраски для повторного применения раствор красителя фильтровали через бумажный фильтр, а обесцвечивающий раствор — черев активированный уголь, достигая таким образом полной абсорбции растворенной краски.

Дуга Gc-компонента располагается в непосредственной близости от траншеи с антисывороткой (рис. 3). Для типа Gc 1 — 1 характерна короткая крутая дуга, пересекающая катодным концом дугу АЛЬФА2-макроглобулина. Тип Gc 2—2 выявлялся также в виде короткой вогнутой дуги, значительно сдвинутой в сторону катода и пересекавшей своим анодным концом дугу АЛЬФА2-макроглобулина. Тип Gc 2—1 характеризуется маловогнутой плоской длинной дугой с 1 или 2 вершинами. Дуга почти полностью занимает общее расстояние преципитатов Gc 1—1 и Gc 2—2 и располагается параллельно АЛЬФА2-макроглобулину.

Рис. 3. Gc-типы на иммунофореграмме (Gc-компонент обозначен точками).
Сверху вниз: Gel—1, Gc2—1, Gc2—2, Gc2—1. Траншеи заполняли абсорбированной сывороткой анти-Gc.

Для четкого изображения дуг Gc большое значение имеет механическая и электрофоретическая однородность агарового геля; если такой однородности нет, искажается локализация и характерная картина дуг и преципитаты перекрывают друг друга, что значительно затрудняет (или делает вообще невозможной) дифференциацию Gc-групп.

Мы исследовали кровь 633 русских обоего пола — уроженцев различных областей Советского Союза. Возраст испытуемых преимущественно 20—30 лет. Кровь брали у здоровых, а также у больных разными соматическими заболеваниями. Gc-группу сывороток определяли параллельно оба автора, а результаты сравнивали. С момента взятия крови до определения Gc-групп проходило у одного автора 2—5 суток, у второго — 2—3 недели. Кровь в этот период хранили при 4—5°. При сравнении результаты в обоих случаях совпадали, но иногда в одном из них дифференциация Gc-группы была сомнительной, в другом — тип сыворотки этого же образца крови устанавливался четко. Как правило, затруднения возникали в результате технических погрешностей. В 3 пробах крови Gc-диагностика не была достигнута, причем в одном случае

Таблица 3

Распределение Gc-групп у обследованного контингента лиц

Gc-группа	Количество образцов крови		Частота генов
	абс.	%
1-1	319	50,64	Gc1 = 0,704 Gc2 = 0,296
2-1	249	39,52
2-2	62	9, 84
Всего	630	100, 00

Gc-компонента вообще не было, а в 2 других — изображение Gc-дуг было очень неясно. Это не противоречит литературным данным, по которым Gc-группы в среднем у 2—4% людей не определяются (Marek и соавторы, Heifer). При анализе частоты Gc-групп, приведенной в табл. 3, указанные 3 образца крови не учитывали.

Частоту генов высчитывали по формулам:

Gc¹ = Gc1 — 1 + (Gc2 —1)/2; Gc² = Gc2 — 2 + (Gc2 —1)/2,

где Gc 1 — 1, Gc 2—1, Gc 2—2 — частота соответствующего фенотипа.

Результаты распределения Gc-групп и частоты генов хорошо согласуются с опубликованными цифрами Gc-частоты у европейского населения.

Из числа исследованных 55 женщин были беременны. У большинства из них кровь брали перед родами. При этом группа Gc 1—1 установлена у 27 женщин, Gc 2—1 — у 25, Gc 2—2 — у 3. 35 человек страдали ревматизмом, из них у 18 кровь относилась к группе Gc 1—1, у 11 — к группе Gc 2—1, у 6 — к группе Gc 2—2. Таким образом, по нашему материалу, беременность и заболевание ревматизмом не препятствуют установлению сывороточного фактора Gc.

Gc-компонент определяли и с помощью выпущенных Научно-исследовательским институтом судебной медицины Министерства здравоохранения СССР сывороток, преципитирующих белок человека. Были испытаны такие сыворотки 9 серий выпуска 1962—1966 гг. Стандартные сыворотки вводили в реакцию без предварительной обработки, а преципитирующую сыворотку каждой серии исследовали 25—30 нормальными сыворотками с известной Gc-группой. Одновременно ставили контроль с сывороткой анти-Gc. Реакцию проводили по описанной методике.

Gc-группу успешно устанавливали преципитирующими сыворотками 4 серий. Преципитирующие сыворотки остальных серий четкого Gc-преципитата не образовали.

Выводы

1. Сывороточный фактор Gc, обладающий генетически обусловленными групповыми различиями и выявляемый иммуноэлектрофоретическим методом, в судебно-медицинской практике можно использовать в экспертизах по делам о спорном отцовстве, материнстве и замене детей.

2. При исследовании крови 630 человек русской национальности установлена следующая частота Gc-групп: Gc 1—1 — 50,64%, Gc 2—1 — 39,52%, Gc 2—2 — 9,84%. Частота генов: Gc¹ — 0,704, Gc² — 0,296.

3. Беременность и заболевание ревматизмом у обследуемых женщин определению Gc-групп не препятствовали.

4. В качестве сывороток анти-Gc можно применять некоторые серии сывороток, преципитирующих белок человека, выпускаемые Научно-исследовательским институтом судебной медицины Министерства здравоохранения СССР.

 

¹ Институт судебной медицины (дир. — проф. О. Прокоп) университета им. Гумбольдта (Берлин).