Дифференциация в смешанных пятнах антигена А выделений от антигена А крови при помощи лектина

Достоверное дифференцирование групповой принадлежности крови и выделений человека в смешанных пятнах затруднительно.

Научные данные ориентируют на использование для этой цели 2 возможностей.

Первая из них, уже реализованная в практике, заключается в способности изосывороток α и β в противоположность иммунным кроличьим сывороткам анти-А и анти-В реагировать с антигенами выделений интенсивнее, чем с антигенами крови. Поэтому если в пятне, образованном смесью крови и выделения, содержится умеренное количество антигена выделения, то дифференциация будет возможна путем параллельного исследования объекта изосыворотками α и β и иммунными кроличьими сыворотками анти-А и анти-В.

Вторая возможность возникает благодаря тому, что концентрация групповых антигенов в слюне и сперме больше, чем в крови. Однако свойства известных группоспецифических сывороток не позволяют использовать этот факт для анализа смешанных пятен.

Мы частично разрешили этот вопрос (в отношении антигена А), изучая в реакции абсорбции лектин (фитогемагглютинии) анти-A₁, извлекаемый из семян Dolichos biflorus L.

Материал и метод

Лектин апти-А₁ ранее исследованный нами в реакции агглютинации¹ получали из семян Dolichos biflorus L. (Bird, 1951), 2 образца которых были выращены в СССР и 2 — в Индии. Водно-солевые экстракты из семян этих образцов имели титр 1:32—1:256, но в реакции абсорбции различий не проявляли. После изготовления экстракты использовали в течение не более 3 месяцев. Все они обладали высокой серологической специфичностью и даже в реакции Доссе — Видаля (трипсин — альбумин-тест), когда титр повышался до 1:2 млн., не реагировали с эритроцитами групп 0 и В.

Реакцию абсорбции осуществляли при 3—10° в течение 18—20 часов, добавляя к 50 мг мелко нарезанной марли, пропитанной кровью или выделением, 0,3 мл экстракта (или сыворотки).

В реакции задержки агглютинации слюну разводили физиологическим раствором, добавляли равный объем экстракта или изосыворотки, смесь выдерживали 1 час при комнатной температуре и затем проводили реакцию агглютинации нижеописанным способом.

Реакцию гемагглютинации при титровании экстракта и изосыворотки α ставили в пробирках с центрифугированием: к 3 каплям экстракта (или его разведения) добавляли 1 каплю 2% взвеси неотмытых стандартных эритроцитов группы А₁ (встряхивали, центрифугировали 2 мин. при 1500 об/мин и после легкого встряхивания учитывали результат невооруженным глазом и под микроскопом. Для кроличьей сыворотки анти-А применяли агглютинацию на плоскости. Титровали экстракт и сыворотки, разводя их физиологическим раствором в 2, 4, 8, 16 раз и т. д.

Результаты исследований

Отправным пунктом послужил опыт, показавший, что лектин анти-A₁ с титром 1:32 полностью абсорбировался пятном слюны группы A₁Se, но не абсорбировался пятнами слюны группы OSe и BSe и пятнами крови группы 0, A₁, В. Повторные и контрольные эксперименты подтвердили правильность полученного факта, в котором мы усмотрели проявление особых свойств лектина, весьма ценных для судебной медицины.

В дальнейших опытах мы прежде всего стремились выяснить, постоянно ли свойство лектина не вступать в соединение с высохшей кровью и не зависит ли оно от групповых и индивидуальных свойств крови. С этой целью в реакции абсорбции исследовали пятна 58 образцов крона (15 — 0 и В и 43 — А и АВ). Давность большинства пятен не превышала недели. Вне зависимости от того, имел ли экстракт титр 1:32 или 1:16, в отношении крови групп А и АВ ни разу не наблюдали снижения титра более чем на одну ступень. Пятна крови группы 0 и В совсем не снижали титр. Не имела значения половая принадлежность крови, а также то, была ли это кровь выделителей или невыделителей. Полученное доказательство функциональной неспособности экстракта реагировать с сухой кровью, как и ориентировочные данные о взаимодействии его с пятнами слюны, содержащей антиген А, послужило основанием для попытки использовать экстракт для дифференциации в смешанных пятнах антигена А слюны от антигена А крови.

Было установлено, что пятна слюны специфически абсорбируют экстракт. Доказательством этого служило отсутствие снижения титра или снижение его только на одну ступень пятнами слюны групп 0 и В (выделителей и невыделителей) и групп А и АВ (невыделителей). С другой стороны, пятна слюны выделителей групп А и АВ абсорбировали экстракт, причем па абсорбцию влияли те факторы, которые в этом отношении характерны для реакции соединения антитела с антигеном. Так, экстракт с титром 1:16 обеспечивал полное связывание фитагглютинина в большем числе случаев, чем с титром более высоким (1:32, 1:64). Абсорбция протекала тем интенсивнее, чем более насыщенным и свежим было пятно; напротив, если перед тем, как сделать

Таблица 1

Реакция абсорбции экстракта анти-А₁ пятнами крови, слюны и смешанными пятнами

пятно, слюну предварительно выдерживали в жидком состоянии, то абсорбционные свойства ее резко снижались или полностью утрачивались.

Особого внимания заслуживает зависимость абсорбционной способности образца слюны от принадлежности человека к одной из подгрупп — A₁—А₂ или A₁B—А₂В. В общем она была существенно выше с антигеном А₁, чем с А₂, и у группы А, чем у АВ. Наряду с этим отмечали случаи, когда слюна группы A₁Se при прочих благоприятных условиях не абсорбировала экстракт. Тем не менее 4 образца пятен слюны A₁Se давностью 4 года полностью связали фитагглютинин с титром 1:16. Пятна слюны некоторых сильных выделителей обусловливали полное поглощение даже при титре экстракта 1:64. Это позволило считать титр 1:16 (при кратном разведении) оптимальным. С одной стороны, кровь снижает его не более чем на одну ступень. С другой стороны, этот титр обеспечивает уверенное выявление антигена А. Разумеется, смежное титрование (в близких разведениях) для целей дифференциации недопустимо.

Дифференциацию осуществляли с пятнами, содержащими только кровь и только слюну, а также со смешанными пятнами, образованными путем выливания слюны на еще не высохшие пятна крови.

Как видно из табл. 1, экстракт обеспечивает выявление антигена слюны у сильного выделителя вне зависимости от группы крови, с которой смешана слюна. Продемонстрированы также пониженная абсорбционная способность слюны у лиц группы A₁B и отсутствие ее у некоторых выделителей группы А₁ Экстракт четко дифференцировал антигены слюны и крови и в тех случаях, когда они происходили от одного лица.

Обозначения. Кр — пятно крови Сп. — пятно спермы. Сп. + Кр. — пятно спермы пропитанное кровью.

Таблица 2

Результаты абсорбции экстракта антн-А₁ пятнами спермы (группы ASe с давностью 3 года), пропитанными свежей кровью группы А₁

Ориентировочные опыты с пятнами спермы и выделений из носа привели к удовлетворительным результатам. Антиген А спермы выявлялся даже тогда, когда старые пятна спермы (давностью 3 года) и произошедшие от выделителей группы А были обильно пропитаны свежей кровью группы A₁ (табл. 2). Хотя все образцы пятен спермы, данные о которых приведены в табл. 2, в реакции абсорбции обусловливали полное связывание изоагглютинина α с титром 1:32, антиген А обнаружили только в 3 образцах. Осталось неизвестным, относились ли лица, чью сперму исследовали, к подгруппе A₁ или А₂.

По 3—5 ступеней поглощения констатировали с пятнами выделений из носа у выделителей группы A₁ и А₁В. Не наблюдали неспецифического связывания экстракта анти-A₁ пятнами, образованными выделениями из носа лиц групп OSe и BSe.

Ни одно пятно мочи из 15, из которых 12 относились к группам А и АВ, нс снижало титр более чем па 2 ступени. Не оказывали неблагоприятного влияния плательные ткани 12 распространенных образцов и марля.

Приведенный материал позволяет считать антиген А достоверно выявленным, если в реакции абсорбции титр экстракта снизился хотя бы на 3 ступени (учитывая влияние предмета-носителя на титр).

Это мнение подтверждается отсутствием снижения титра более чем на 1 ступень кровью любой группы и выделениями, не содержащими антиген А. Отмстим также, что при титровании экстракта разведение, в котором агглютинация видна невооруженным глазом, отделяется не более чем 2 ступенями от разведения, в котором агглютинации нет. Это свойство экстракта уменьшает возможность искажения результатов реакции вследствие технических погрешностей титрования.

Выяснению причины дифференцирующих свойств экстракта анти-A₁ способствовала реакция абсорбции, в которую было введено 3 реагента: изосыворотка α, кроличья сыворотка анти-А и экстракт анти-А₁. Исследовали кровь и слюну 2 лиц группы A₁Le (а—b+).

Результаты реакции абсорбции показали (табл. 3) существенно меньший авидитет экстракта по сравнению с сыворотками. Реакция задержки агглютинации, проведенная со слюной этих же лиц (табл. 4), позволила установить, что, хотя антиген А находился в слюне обоих лиц в достаточном количестве, в слюне второго лица его содержалось меньше. Агглютинация, вызываемая экстрактом с титрам 1:32, не задерживалась совсем, и она отмечалась только при титре экстракта 1:4, причем со слюной второго лица она была в 4 раза меньшей.

Таблица 3

Сопоставление действия серологических регентов в реакции абсорбции

Обозначения. К — пятно крови; С — пятно слюны; К+С — смешанное пятно. Цифры обозначают количество ступеней поглощения.

Для сравнительной оценки авидности экстракта провели абсорбцию с пятнами слюны, предварительно (до высушивания) разведенной физиологическим раствором в 2, 5, 7, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 200, 400, 600, 800, 1000, 5000, 10 000, 15 000 раз. Титр сывороток α и анти-А был 1:32, титр экстракта — 1:16. Оказалось, что последнее разведение слюны, в котором еще достоверно выявлялся антиген (т.е. титр падал не менее чем на 3 ступени), для экстракта было 1:5, для, кроличьей сыворотки — 1:90, для изосыворотки — 1:5000. Таким образом, в этом опыте авидитет экстракта был в 18 раз меньшим, чем у гетеросыворотки, и в 1000 раз меньшим, чем у изосыворотки.

Таблица 4

Реакция задержки со слюной двух выделителей группы А₁

Следовательно, сущность описанного эффекта дифференциации обусловлена благоприятным сочетанием 2 факторов: весьма низкой в реакции абсорбции авидностью экстракта и большим (по сравнению с кровью) количеством антигена в некоторых выделениях. В то же время экстракт характеризуется парадоксальным несоответствием (с точки зрения устоявшихся представлений о сыворотках) между выраженной гемагглютинационной способностью и слабой склонностью абсорбироваться. Причина этого неизвестна. Тем не менее это еще раз подтверждает данные, имеющиеся в отношении иммунных сывороток, об отсутствии зависимости авидитета от титра.

Экспертные суждения по данным, полученным при исследовании вещественных доказательств с применением экстракта анти-A₁, ограничены в связи с отсутствием аналогично действующего экстракта анти-В.

Поэтому положительный результат реакции с экстрактом анти-A₁ может служить основанием не для диагностики группы выделения, а лишь для вывода о наличии антигена А в выделении.

Однако в отдельных случаях можно судить и о группе выделения. Например, потерпевшая, относящаяся к категории невыделителей, имеет группу А. Пятно крови, смешанное со спермой, абсорбирует изоагглютинин α, иммунный агглютинин анти-А и лектин анти-A₁, но не взаимодействует ни с одним из реагентов анти-В. Это даст основание утверждать, что сперма произошла от выделителя группы А (при условии изнасилования одним лицом).

Кроме того, если пятно выделения (слюна, сперма) без примеси крови интенсивно абсорбирует лектин анти-Ai, а свежевысушенное соответствующее выделение подозреваемого не абсорбирует лектин вовсе или абсорбирует его в незначительной степени, то можно исключить происхождение выделения от данного подозреваемого.

Отрицательный результат абсорбции лектина анти-A₁ пятном, в котором кровь смешана со спермой, слюной или выделением из носа, может быть следствием ряда причин: 1) выделение произошло не от лица группы А или АВ; 2) выделение произошло от лица группы А или АВ — либо невыделителя, либо выделителя группы A₁ или A₁B, с выделениями которого экстракт не реагирует (см. табл. 3), либо выделителя группы А₂ или А₂В (в последнем случае слабо положительный результат абсорбции лектина анти-A₁ иногда наблюдается лишь при исследовании свежих интенсивных пятен); 3) пятно выделения лица группы A₁ или А₁В было поверхностным или абсорбционная способность антигена выделения была ослаблена в силу изменения объекта исследования.

Таким образом, только положительный результат реакции абсорбции (при учете влияния на экстракт контрольных участков предмета-носителя) позволяет делать утвердительные экспертные выводы.

Из изложенного вытекает недопустимость применения экстракта анти-Ai для определения категории выделительства и широкого использования его для исследования выделений, не смешанных с кровью.

Несмотря на то что пока не найден экстракт анти-В, который по своим свойствам был бы аналогичен описанному экстракту анти-А₁, наш прогноз все же оптимистичен: учитывая огромное разнообразие растительных веществ, уникальность подобных экстрактов можно считать сомнительной.

¹ «Проблемы гематологии», 1967, № 3.