Изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного типирования ДНК

 

 

 

ЗЕМСКОВА Елена Юрьевна

 

 

 

Изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного типирования ДНК

 

 

14.00.24 – судебная медицина

 

 

 

 

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

 

 

 

 

 

 

 

 

Москва 2008

Работа выполнена в отделе судебно-медицинских молекулярно-генетических научных и экспертных исследований Федерального Государственного учреждения «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава»

 

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Иванов Павел Леонидович

 

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор

Пашинян Гурген Амаякович

доктор медицинских наук

Лапенков Михаил Иванович

 

Ведущая организация: ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава

 

 

Защита состоится «19» июня 2008 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 280.070.01 при ФГУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава» по адресу: 125284, Москва, ул. Поликарпова, д.12/13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава»

 

Автореферат разослан «_____» ________________ 2008 г.

Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат медицинских наук, доцент О.А. Панфиленко

 

 

 

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Объекты биологической природы являются самыми распространенными вещественными доказательствами по многим категориям уголовных и гражданских дел. Результаты их судебно-медицинских экспертных исследований служат важнейшей доказательной базой при расследовании и раскрытии преступлений и изобличении лиц, их совершивших.

Поэтому методические подходы, направленные на разрешение задач в области судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств биологического происхождения, являются одними из наиболее востребованных в современной судебной науке. Их совершенствование и повышение эффективности представляет значительный интерес для судебных и следственных органов.

Все это, а также прогресс в области фундаментальных исследований и технологий, активное внедрение их результатов в практику, предопределяет неизбежное углубление содержания и расширение возможностей судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств, и в первую очередь, судебно-медицинских молекулярно-генетических исследований.

В последние годы наблюдается все более масштабное развитие новейших высокотехнологичных разработок в области анализа ДНК. Тем не менее, для целей судебно-медицинской экспертной практики не теряют актуальности базовые варианты молекулярно-генетических технологий. По сравнению с методиками, основанными на использовании роботизированных станций и автоматических генетических анализаторов, трудоёмкость и время анализа выше, но стоимость используемого оборудования и реагентов заметно меньше. Речь, в первую очередь, идет о ставшем уже классическим, анализе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК с помощью гель-электрофореза с последующей визуализацией электрофоретической картины путем окрашивания бромидом этидия или серебром.

Этот методический подход подробно описан, и его принципы положены в основу индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, широко используемых в судебно-медицинской молекулярно-генетической экспертизе [Иванов П.Л., 1999; Иванов П.Л., 2001; Иванов П.Л., 2003]. Он является весьма эффективным экспертным инструментом, и позволяет решать на высоком уровне доказательности самые сложные экспертные задачи. В то же время, он характеризуется высокой степенью сложности, в частности, в интерпретации полученных данных, и содержит в себе опасность экспертных ошибок, которые могут быть обусловлены недостаточно полным знанием свойств самого используемого инструмента, то есть, свойств тех молекулярно-генетических тест-систем, которые применяются в анализе. Очевидно, что это может приводить к самым серьезным следственным и судебным ошибкам.

В этом плане, углубленное знание аналитических свойств применяемых систем молекулярно-генетического типирования способно повысить эффективность работы эксперта, обеспечив его дополнительной информацией, необходимой для адекватной интерпретации получаемых экспертных данных. Поэтому изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного типирования ДНК представляется весьма важной и актуальной исследовательской задачей.Цель и задачи исследования

Цель диссертационной работы заключалась в проведении комплекса научно-методических исследований, направленных на дальнейшую методическую разработку судебно-медицинских ас­пектов применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, в частности, на изучение их аналитических характеристик, определения диапазона возможностей и ограничений, а также особенностей их использо­вания для решения конкретных экспертных задач.

В соответствии с этим были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи, имеющие теоретическое и прикладное значение:

Изучить особенности амелогенинового ДНК-теста определения биологического пола применительно к анализу половой принадлежности ДНК в смешанных биологических следах, содержащих биологический материал человека и животных;

Изучить свойства гетерологических маркерных систем - стандартов молекулярных масс, - определить диапазон возможностей и ограничений применения размерных стандартов данного типа при судебно-медицинском фрагментном анализе ДНК;

Изучить аналитические характеристики некоторых молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, применяющихся в современной судебно-медицинской практике, включая уточнение номенклатуры аллельных вариантов и изучение потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК, и оценить судебно-медицинское значение выявленных свойств;

Изучить популяционные характеристики некоторых индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, применяемых для судебно-экспертного типирования ДНК, с целью оценки идентификационной значимости признаков, анализируемых на уровне ДНК.

Научная новизна и практическое значение работы

Настоящая работа является частью комплексных исследований полиморфизма ДНК в аспекте судебно-медицинской идентификации личности и установления биологического родства, проводимых в отделе молекулярно-генетических научных и экспертных исследований Российского центра судебно-медицинской экспертизы Росздрава. Таким образом, данная работа непосредственно связана с процессом разработки, развития и внедрения новых высокоэффективных технологий геномной идентифи­кации в сферу деятельности отечественной судебно-медицинской экспертизы.

Проведенное в диссертационной работе целе­направленное научное исследование и углубленная разработка практических основ использования молекулярно-генетических индивидуализирующих тест-систем, основанных на анализе ПДАФ хромосомной ДНК применительно к анализу вещественных доказательств биологического происхождения, открывает новые аспекты судебно-экспертного типирования ДНК. Кроме того, оно представляется весьма актуальным и важным с точки зрения вопросов, решаемых судебно-медицинской идентификационной экспертизой. Результаты диссертации могут служить дополнительным материалом для обеспечения системного внедрения молекулярно-генетических мето­дов идентификации личности и определения биологического родства в практическую судебно-медицинскую деятельность экспертизы России.

Результаты работы нашли применение при проведении более чем 700 экспертиз, в числе которых идентификационные исследования по установлению личности неопознанных жертв террористических актов в Москве в 1999 г., останков генерала Г.Н. Шпигуна - заложника, погибшего в Чеченской Республике в 2000 г., останков украинского журналиста Г. Гонгадзе в 2001 г., массового убийства малолетних детей в Красноярске 2005 г., убийства женщин, сопряженные с их изнасилованиями на территории Иркутской области в период с 1994 по 2000 г.г., умышленного убийства губернатора Магаданской области В.И. Цветкова в 2002 г., идентификация неопознанного тела задержанного по подозрению в подготовке теракта и погибшего при проведении следственных действий гражданина А.Г. Пуманэ, убийства женщин на территории Битцевского лесопарка в г. Москве 2006-2007 гг., а также идентификационные экспертизы, проведенные в рамках расследования целого ряда других преступлений, имеющих общественный резонанс.

 

Основные положения, выносимые на защиту

1. Амелогениновый ДНК-тест определения биологического пола не является абсолютно видоспецифичным. При судебно-экспертном типировании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК животных, существует опасность ложного определения мужского пола в следах женского происхождения. В биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола. Этому может способствовать неправильно подобранный стандарт молекулярных масс, его удаленное расположение на геле или использование неточного расчетного алгоритма для определения размеров анализируемых фрагментов.
2. Принципиальное значение для правильной идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов ДНК имеет условие, что размерные стандарты (стандарты молекулярных масс) и анализируемые фрагменты гомологичны, то есть, представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями. В ином случае - если нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК оказываются различными (такие ДНК называют гетерологичными), нельзя исключить, что в определении размеров фрагментов могут быть допущены серьезные ошибки, обусловленные различиями в физико-химических, и, как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом.
3. Разрешены выявленные в литературных источниках и имеющие принципиальное значение противоречия, касающиеся структурной организации аллелей полиморфных локусов хромосомной ДНК человека D1S111 и HUMCD4. Преодоление этих противоречий важно с точки зрения применения этих молекулярно-генетических маркеров в судебно-медицинских молекулярно-генетических идентификационных исследованиях и при формировании референтных баз данных.
4. Между микросателлитными локусами генома человека vWA и vWFII существует достоверная генетическая взаимозависимость (неравновесие по сцеплению). Это означает, что при типировании локусов vWA и vWFII в составе одной мультилокусной панели, ввиду показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) неприемлемо.

 

Апробация работы

Материалы диссертации отра­жены в научных статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах и изданиях, определённых Высшей аттестационной комиссией, в том числе, в журнале "Судебно-медицинская экспертиза" (8 статей), а также в публикациях по материалам научных съездов и конференций. Всего по теме диссертации опубликовано 11 работ. Результаты диссертации докладывались на пяти научных конференциях Российского центра судебно-медицинской экспертизы, а также на 4, 5 и 6 Всероссийских съездах судебных медиков (Владимир, 1996; Астрахань, 2000; Тюмень, 2005). Апробация работы состоялась 10 апреля 2008 г. на расширенной научно-практической конференции ФГУ «РЦ СМЭ Росздрава».

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 148 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 224 источника отечественных и зарубежных авторов.

 

содержание работы

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования послужили образцы жидкой крови и образцы крови на материале-носителе - марлевые, ватные и бумажные тампоны и аппликаторы, FTA-карты, следы крови и биологических выделений, следы слюны на окурках сигарет, образцы слюны на марлевых тампонах, мышечные ткани, части тела и другие объекты от неопознанных трупов людей и расчлененных трупов, мазки (соскобы) со слизистой оболочки ротовой полости, волосы, гистопрепараты, парафиновые блоки и др., - порядка 1500 объектов, которые были представлены на экспертизу в ФГУ «РЦ СМЭ Росздрава» по более чем 700 уголовным и гражданским делам, при расследовании которых возникла необходимость судебно-медицинского исследования вещественных доказательств для целей идентификации личности или установления биологического родства.

При изучении видовой специфичности амелогениновой системы установления генетического пола для выделения ДНК использовали образцы слюны домашних животных - 8 кошек и 5 собак. Препараты ДНК животных экстрагировали из крови и мышечной ткани крупного рогатого скота, свиньи, барана и домашней птицы (курица). Всего было исследовано 13 образцов животных и птицы.

При изучении аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, уточнении номенклатуры аллельных вариантов, изучении потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК были проанализированы более 2000 препаратов амплифицированной ДНК - продуктов ПЦР, фракционированных электрофоретически в агарозных, полиакриламидных гелевых средах и анализированных в УФ-свете после окрашивания бромидом этидия или визуализированных путем окрашивания серебром.

Для оценки генетического разнообразия и вероятностно-статистического анализа дан­ных использовали компьютерные программы SPSS v 7.5 for Windows, RxC (Rown x Columns) на основе алгоритма, описанного ранeе [Roff & Bentzen, 1989], Arlequin [Schneider S. e.a., 2000], GDA [Lewis P. e.a., 1999] и PowerStats [Tereba A. e.a., 1999].

Результаты и обсуждение

1. Изучение видовой специфичности амелогениновой системы установления генетического пола

Амелогениновый тест на половую принадлеж­ность ДНК широко используют в судебном молекулярно-генетическом идентификационном ана­лизе по причине его надежности и простоты. Кро­ме того, считается, что он превосходит по чувстви­тельности многие известные на сегодняшний день амплификационные индивидуализирующие системы, оперирующие на уровне хромосомной ДНК чело­века, позволяя даже в базовой постановке (УФ-детекция) диагностировать генетическую по­ловую принадлежность препаратов, содержащих единичные молекулы ДНК.

В настоящей работе мы использовали праймеры, позволяющие амплифицировать очень короткие участки, содержащие X/Y-гетероморфный сайт: Х и Y-специфические продукты амплификации имеют длину соответственно 106 и 112 п.н.; дублет 106/112 п.н. – «XY» - соответствует мужскому генетическому полу, а полоса 106 п.н., представляющая на самом деле дублет 106/106 п.н. – «ХХ» - женскому (рис. 1а).

Препараты ДНК, экстрагированной из биологических образцов крупного рогатого скота, свиньи, барана и домашней птицы, животных семейства псовых (собака) и вида кошачьих (кошка), использовали в качестве мат­рицы для постановки ПЦР. При этом было установлено, что ДНК всех исследованных организмов, кроме домашней птицы, дают положительный сигнал (рис. 1б). а) М 1 2 б) М 3 4 5 6 М

Рис. 1. Электрофоретическое фракционирование фрагментов гена амелогенина, амплифицированных на матрице ДНК а) мужчины и женщины (дорожка 1 и 2 соответственно); б) в препаратах, полученных из биологического материала от коровы, быка, свиньи и барана (дорожки 3,4,5,6 соответственно) в ПААГ с концентрацией 8%. М – маркерные фрагменты ДНК pBR322/MspI. Окрашивание бромидом этидия. Размеры указаны в парах нуклеотидов. УФ-визуализация.

При этом видно, что амплификационный продукт для всех ДНК животных был получен одинакового размера, из чего можно сделать вывод об отсутствии межвидового полиморфизма нуклеотидных последовательностей гена амелогенина у исследованных организмов. Примечательно, что и внутри каждого вида во всех исследованных слу­чаях (независимо от пола животных) продукт амплификации локуса амелогенина также являлся мономорфным. Это означа­ет, что в отличие от ДНК человека, для ДНК иссле­дованных животных амелогениновый тест не мо­жет служить пол-специфическим маркером.

На электрофореграмме (рис. 2а) хорошо видно, что продукты амплификации, полученные на матрице ДНК коровы, барана и ДНК женщины, визуализировались как фрагменты, различавшиеся по размерам на очень небольшую величину. Измерения показали, что фрагменты ДНК животного происхождения имели длину 103 п..н.

Полученный результат дает основания считать вполне возможным получение "нетипичных" продуктов амплификации при судебно-экспертном типировании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым ока­залась примешана ДНК (домашних) животных. Мы подтвердили это предположение эксперимен­тально: при смешивании продуктов амплификации вышеуказанных препаратов и внесении их в одну дорожку ПААГ, амплификационнные фрагменты выглядели как фрагменты, свойственные мужской ДНК, хотя их размеры отличались: получился дублет 103/106 п.н., тогда как дублет XY имеет размер 106/112 п.н. (рис. 2б). На это нужно обращать особое внимание при выполнении экспертных исследований, так как дублет 103/106 п.н. ошибочно мо­жет быть воспринят экспертом как характеристи­ческий признак мужской ДНК - дублет XY 106/ 112 п.н. (ср. с рис.1а).
а) 1 2 М 3 б) М 4

Рис. 2. Электрофоретическое фракционирование продуктов амплификации гена амелогенина а) в препаратах ДНК коровы, барана и препарата женской ДНК (дорожки 1,2,3 соответственно); б) в экспериментальном препарате.

Следующим экспериментом была совместная амплификация гена амелогенина на матрице ДНК, выделенных из биологических образцов человека и животных. На рис. 3 приведены результаты опыта, показывающего, что при введении в реакционную смесь ДНК мужчины/женщины в смеси с ДНК крупного рогатого скота амплификационные фрагменты выглядели соответственно как триплет и дублет. Подобные результаты получены также при типировании препаратов ДНК, в которых ДНК человека была смешана с ДНК собаки или кошки.

Очевидно, что с точки зрения судебно-меди­цинской экспертизы особую опасность представ­ляет случай смешения ДНК животного именно с ДНК женщины (рис. 3, дорожка 2), поскольку дублет 103/106 п.н. при поверхностной оценке мо­жет быть воспринят экспертом как характеристи­ческий признак мужской ДНК, то есть как дублет XY 106/ 112 п.н. (рис. 3, дорожка 5).

В случае неправильно подобранного стандарта молекулярных масс, его отсутствия или удаленного расположения, а также неточного определения характера зависимости электрофоретической подвижности анализируемого фрагмента от его размера, такая ситуация может привести к неправильной интерпретации результата типирования.

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов совместной амплифика­ции гена амелогенина в смеси ДНК барана с ДНК мужчины и женщины (дорожки 1 и 2 соответственно), продуктов амплификации гена амелогенина в ДНК барана (дорожка 3), продуктов амплификации контрольных женской и мужской ДНК (дорожки 4 и 5 соответ­ственно) (условия электрофореза см. рис. 1).

Так, на­пример, при смешении крови человека с кровью животного возможно ложное определение мужско­го пола в следах женского происхождения (как это показано в приведенном выше примере - рис. 3). В свою очередь в биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола.

В этом плане большое значение играет качество гель-электрофоретической системы. На рис. 4 приведены результаты смоделированного электрофореза, при котором специально были нарушены технологические параметры, такие как напряженность электрического поля – в сторону увеличения, а также нарушение технологии приготовления геля - концентрация полиакриламида в растворе была уменьшена.

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации гена амелогенина в ДНК барана, коровы, свиньи (дорожки 3,4,5 соответственно), продуктов амплификации контрольных женской и мужской ДНК (дорожки 1 и 2 соответ­ственно) в ПААГ с концентрацией 5%. М – маркерные фрагменты ДНК pBR322/MspI. Окрашивание бромидом этидия. Размеры указаны в парах нуклеотидов. УФ-визуализация.

При этом на первый взгляд, была получена картина линейного искажения подвижности амплифицированных фрагментов ДНК. Однако эта ошибка может представлять очевидную опасность при невнимательной оценке, т.к. фрагмент 103 п.н. можно с уверенностью принять за фрагмент длиной 106 п.н., что также приведет к ложному определению женского пола.

2. Изучение свойств гетерологических маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК

Отождествление или дифференциация объектов экспертизы осуществляется на основании сравнительного анализа (совпа­дение - несовпадение) индивидуализирующих при­знаков ДНК – генотипических характеристик полиморфных локусов, - выявленных в ходе исследования. Для правильного решения экспертной задачи требуется установить (идентифицировать) выявленные аллели, то есть в точности определить, какие именно аллели данного локуса совпали. Аллели, которые сильно разнятся по частоте встречаемости, могут различаться по размеру весьма незначительно - всего на одно повторяющееся звено, а это для некоторых локусов всего 2-3% длины фрагмента. Если на геле один из таких аллелей ошибочно принять за другой, то это может обусловить серьезные ошибки в выводах.

На практике для идентификации аллелей определяют условный молекулярный размер фрагментов ДНК - например, длину в парах нуклеотидов. Часто размер фрагментов определяется расчетным путем на основании измерений их пробега на электрофореграмме. Для этого нужно проанализировать профиль электрофоретического разделения для данного конкретного геля и оп­ределить точный характер зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров с использованием специальных алгоритмов и стандартов молекулярных масс. Однако следует подчеркнуть, что принципиальное значение для всех алгоритмов имеет условие, что стандарты (маркерные фрагменты) и анализируемые фрагменты - гомологичны, то есть, представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями. Между тем, на практике это условие не всегда выполняется, и тогда нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК оказываются различными. Такие ДНК называются гетерологичными. В этом случае нельзя исключить, что в определении размеров фрагментов могут быть допущены серьезные ошибки, обусловленные различиями в физико-химических, и как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом.

Так, при измерении фрагментов локуса D1S80 в ПААГ по маркеру pBR322/AluI мы наблюдали позиционное искажение при определении молекулярного веса амплифицированных фрагментов ДНК, что выражалось в неправильном определении аллельного профиля ДНК – например, контрольная ДНК была определена как фрагмент, отличающийся от истинного на 3 аллеля (таблица 1).

Таблица 1

Наблюдаемая погрешность (%) при определении размеров амплифицированных фрагментов контрольной ДНК по локусу D1S80

При измерении маркёрных фрагментов относительно друг друга в нативном ПААГ, т.е. фрагментов с известными молекулярными массами, погрешность измерения составила порядка 10%, как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения.

Надо заметить, что в целом, гели агарозы в гораздо меньшей степени, чем полиакриламидные среды, чувствительны к слу­чайным флуктуациям в макроструктуре молекул ДНК, и потому менее склонны к артефактам, которые могут приводить к позиционным искажениям в анализируемом геномном профиле. По этой причине для дальнейшей работы мы ис­пользовали только гели агарозы. При этом учитывался тот факт, что разделяющая способность обычных агарозных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера намного ниже, чем у полиакриламидных. Для разделения же аллелей локусов с варьирующимся чис­лом тандемных повторов, таких как STR-локусы (дли­на повторяющейся последовательности 2-4 п.н.) и VNTR-локусы с коротким шагом (в частности, минисателлитного локуса D1S80, где длина повторяющейся последовательности составляет 16 п.н.), необходимо иметь возможность различать фрагменты ДНК, кото­рые отличаются по длине на 2-3%. Для удовлетворения этих требований в настоящей работе использовали 2,5%-гели специальной агарозы NuSieve или MetaPhor (FMC, США).

Эксперименты по определению размеров амплифицированных фрагментов 3-х разных локусов ДНК - Аро В, D1S80, D1S111 - проводили по разным маркерам - BRL 123, pBR322/AluI, которые наиболее часто используются при производстве молекулярно-генетических исследований в судебной медицине. Также определяли длину маркерных фрагментов BRL 123 по маркеру pBR322/AluI и наоборот, pBR322/AluI по BRL 123, т.е. измерение одних заведомо известных фрагментов по другим заведомо известным размерным стандартам.

Определяемые размеры маркерных фрагментов pBR322/AluI, BRL 123 при проведении двадцати серий контрольных тестов в геле агарозы NuSieve с концентрацией 2,5 %, продемонстрировали отклонения от ожидаемых размеров, как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения от 3,5% до 2,44% (таблица 2). Примечательно, что одинаковые маркерные фрагменты давали разные погрешности при определении их размеров по разным маркерам.

Таблица 2

Наблюдаемые погрешности (%) при определении размеров маркерных фрагментов pBR322/AluI

Ожидаемый размер, п.н.	Наблюдаемый размер, п.н.	Погрешность, %
910	898	-1,32
659	655	+0,61
521	517	-0,77
403	394	-2,28
281	275	-2,14
257	252	-1,95
226	228	+0,89

Полученный массив данных наглядно демонстрирует, что генотипические характеристики, рассчитанные с использованием гетерологичных стандартов молекулярных масс, действительно могут довольно сильно отличаться в зависимости от природы маркера и самого анализируемого локуса. При этом расчет алгоритма погрешности аналитической системы в каждом конкретном случае - для тех или иных размерных стандартов - зависит от многих факторов. Это не позволяет провести стандартизацию нормирования ошибки для каждой гетерологичной системы.

Соответственно, надо признать, что точное определение размеров анализируемых фрагментов по гетерологичным стандартам молекулярных масс оказывается весьма проблематичным, и как минимум, требует использования дополнительного контрольного образца ДНК с заранее известным генотипом по каждому исследуемому локусу. Но даже в этом последнем случае, важно понимать, что генотипические характери­стики, получаемые расчетным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетеро­логичных стандартов молекулярных масс, являются не абсолютными, а относительными или условными и потому не могут быть напрямую использованы как элементы банка данных.

Этот последний вывод был нами подтвержден дальнейшими исследованиями свойств молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе хромосомного локуса D1S111.

3. Изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, оперирующих на уровне полиморфизма длины амплифицированных фрагментов хромосомной ДНК

3.1. Изучение свойств молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе хромосомного локуса D1S111

Уровень полиморфизма хромосомного локуса D1S111 до настоящего времени был охарактеризован недостаточно полно и на относительно малочисленных выборках. Кроме этого, в литературных данных имелись определенные неясности и разночтения, касающиеся структурной организации аллелей данного локуса.

В настоящей работе был проведен сравнительный анализ имеющихся в литературе референтных нуклеотидных последовательностей. Это позволило вывести усредненную «структурную формулу» для минисателлитной ДНК этого локуса.

На основании этой структуры были рассчитаны размеры для всех известных аллелей D1S111, которые приведены в таблице 3. Эти данные, в свою очередь, были нами использованы как опорные параметры для определения основных характеристик полиморфизма данного локуса в репрезентативной выборке российского населения.

Всего было обследовано более 1000 биологических образцов и объектов, принадлежащих лицам из разных регионов России преимущественно русской национальности. В ходе настоящего исследования общая обследованная выборка из гетерогенной популяции была разбита на две группы. Первая группа (далее по тексту - выборка 1) была составлена из числа фигурантов судебно-медицинских экспертиз, назначенных в Бюро СМЭ ДЗ г.Москвы (594 неродственных человека). Вторая группа (выборка 2), объемом в 545 неродственных человек, была сформирована из числа фигурантов судебно-медицинских экспертиз, назначенных в РЦ СМЭ МЗ РФ.

Аллельные варианты локуса D1S111 идентифицировали по внешним стандартам молекулярных масс двумя разными методами. Для выборки 1 в качестве стандарта прямого соответствия использовали искусственно синтезированную "псевдоаллельную лестницу", содержащую 17 негомологичных фрагментов ДНК длиной от 381 до 973 п.н., с шагом в 37 п.н. Эти фрагменты по размеру соответствуют аллелям 9-25 минисателлита D1S111.

Аллельные варианты локуса D1S111 для выборки 2 определяли другим методом: не непосредственным поиском прямого соответствия по размеру, а опосредованно, расчетным путем с помощью аппаратно-программной системы Kodak EDAS 120 (Кодак, США) с использованием в качестве маркера ДНК pBR322/AluI. В таблице 3 приведены результаты, полученные при анализе массива данных по двум выборкам.

Tаблица 3

Распределение аллелей локуса D1S111 в двух исследованных выборках

Аллель	Размер, п.н.	Выборка 1		Выборка 2
		Число наблюдений	Частота аллеля (*)	Число наблюдений	Частота аллеля (*)
9	383	27	0,023±0,004	33	0,030±0,005
10	420	18	0,015±0,004	11	0,010±0,003
11	457	5	0,004±0,002	6	0,006±0,002
12	494	131	0,110±0,009	139	0,128±0,010
13	531	10	0,008±0,003	6	0,006±0,002
14	568	11	0,009±0,003	5	0,005±0,002
15	605	402	0,338±0,014	317	0,291±0,014
16	642	12	0,010±0,003	15	0,014±0,004
17	679	22	0,019±0,004	23	0,021±0,004
18	716	447	0,376±0,014	310	0,284±0,014
19	753	43	0,036±0,005	149	0,137±0,010
20	790	10	0,008±0,003	13	0,012±0,003
21	827	21	0,018±0,004	26	0,024±0,005
22	864	20	0,017±0,004	24	0,022±0,004
23	901	3	0,003±0,001	6	0,006±0,002
24	938	3	0,003±0,001	3	0,003±0,002
25	975	2	0,002±0,001	4	0,004±0,002
26	1012	1	0,001±0,001	0	0,000±0,000
Суммарно		1188	1,000	1090	1,003

Всего нами было выявлено 18 аллелей, содержащих от 9 до 26 повторов (таблица 3). Примечательно, что в ходе настоящего исследования было выявлено 4 новых, то есть не описанных ранее, высокомолекулярных аллеля для этого маркера: это аллели с 23 (901 п.н.) по 26 (1012 п.н.). Значения основных популяционных характеристик локуса D1S111 для обеих исследованных выборок приведены в таблице 4.

По этим данным, информативность D1S111 превышает или сравнима с информативностью таких минисателлитов, как IgH, D17S5 [Чистяков Д.А.и др. 1993; Chistyakov D. e.a., 2000], но уступает таким индивидуализирующим системам как D1S80 и ApoB [Ефремов И.А. и др., 1996; Smolyanitsky A. e.a., 2003].

Распределение аллелей в целом оказалось достаточно сходным в обеих выборках, за исключением двух важных моментов. Во-первых, для самого распространенного в выборке 1 аллеля 18 частота наблюдений в выборке 2 оказалась существенно ниже (0,376 против 0,284). Во-вторых, аллель 19 в выборке 2 наблюдался в 3,8 раза чаще по сравнению с выборкой 1 (0,137 против 0,036). Кроме этого, уровень полиморфизма для выборки 2 оказался существенно выше по сравнению с выборкой 1.

Таблица 4

Значения основных параметров прикладной информативности локуса D1S111 в двух исследованных выборках

Оценочный параметр	Выборка 1	Выборка 2
Объем выборки, человек	594	545
Число выявленных аллелей	18 (9 – 26)	17 (9 – 25)
Число наблюдавшихся генотипов из общего числа возможных, (%)	66 из 171 (39%)	65 из 153 (42%)
Наблюдаемая гетерозиготность	0,685	0,732
Ожидаемая гетерозиготность	0,729 ± 0,008	0,797 ± 0,006
Вероятность случайного совпадения генотипов	0,116	0,071
Дискриминирующий потенциал	0,884	0,929
Потенциал исключения отцовства	0,406	0,480
Усредненный индекс отцовства	1,59	1,87
Индекс полиморфизма	0,69	0,77

Наиболее вероятное объяснение этому заключается в том, что при электрофоретическом определении размеров амплифицированных фрагментов по гетерологичному внешнему высокомолекулярному стандарту ДНК pBR322/AluI имеет место системная ошибка. При этом аллель 18 (716 п.н.) может ошибочно определяться как аллель 19 (753 п.н.).

Это объяснение выглядит достаточно убедительным в свете ранее полученных в работе [Земскова Е.Ю. и др. 2000] данных, касающихся изучения свойств гетерологичных маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК, а именно, что определение размеров амплифицированных фрагментов по нелокусным внешним стандартам ДНК как в агарозных гелях, так и в ПААГ сложным образом зависит от экспериментальных условий и может быть некорректным в определенных диапазонах длин.

2. Уточнение номенклатуры аллельных вариантов и характеристика аллельного полиморфизма молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе пентануклеотидного тандемного повтора HUMCD4

В настоящей работе, в ходе изучения феномена неравновесия по сцеплению между близкорасположенными генети­ческими маркерами (см. раздел 3.3), нами были проведены популяционно-генетические исследования локуса HUMCD4. При этом наше внимание привлекли обнару­жившиеся в источниках литературы существенные разночтения при обозначении аллелей данного ло­куса. Это вызывает определенную путаницу в опи­сании базовых генотипических характеристик дан­ного маркера, является препятствием для его ис­пользования в межлабораторных исследованиях и, как следствие, не позволяет использовать локус HUMCD4 при формировании референтных баз данных.

Проведенная нами аналитическая разработка этого вопроса показала, что причина в том, что в настоящее время для нумерации аллелей микросателлитных локусов может применяться номенклатура, основанная на нумерации тандемных повторов как по одной, так и по другой олигонуклеотидной цепи референтной последовательности ДНК. Однако, дело в том, что в зависимости от того, как именно определена структура повторяющегося звена в тандемно орга­низованной последовательности (так называемый "мотив"), один и тот же вариант аллельного состоя­ния такого локуса может получить разные обозна­чения. Для локуса HUMCD4 это имеет принципиальное значение. При ис­пользовании нумерации по "верхней" цепи тандемный блок содержит 10 пентануклеотидных повто­ров: (ТТТТС)_з(СТТТС)(ТТТТС)₆, тогда как при использо­вании нумерации по "нижней" цепи одно звено - по­втор комплементарного мотива (AAAAG) - теря­ется, и в этом случае насчитывается только 9 пол­ных повторов: (AAAAG)₆(AAAGG) (AAAAG)₂.

Такая ситуация с очевидностью указывает на необходи­мость унификации номенклатуры аллельных вари­антов локуса HUMCD4. Учитывая рекомендации [Gill P. e.a., 1997; Bar W. e.a., 1997], мы сочли целесообразным в качестве стандарта для локуса HUMCD4 принять номенк­латуру, основанную на нумерации повторяющихся тандемных повторов по "верхней" цепи матричной ДНК. В своей дальнейшей работе мы придержива­лись именно этой номенклатуры.

В качестве биологического материала для ана­лиза использовали биологические образцы и объекты от 407 человек из разных регионов РФ с включенными мигрантами из других популяций.

Таблица 5

Распределение аллелей локуса HUMCD4 в исследованной выборке

Аллель	Число наблюдений	Частота аллеля
4	1	0,001
5	286	0,351
6	289	0,355
7	2	0,002
8	1	0,001
9	2	0,002
10	203	0,249
11	24	0,029
12	6	0,007

Всего в исследованной выборке выявлено 9 ал­лелей (таблица 5) и выявлено 16 (36%) из 45 возможных раз­личных генотипов. Наиболее частыми оказались аллели 5, 6 и 10, тогда как на долю остальных 6 аллелей при­шлось всего 4,5% наблюдений. Распределение ал­лелей в целом являлось весьма сходным с анало­гичными данными для других европеоидных попу­ляций (см. например, [Huckenbeck W. e.a., 1997]). Количественная оценка сте­пени различий частотного распределения аллелей в данной выборке по сравнению с другими попу­ляциями не являлась предметом настоящего иссле­дования. Тем не менее, на основании полученных показателей можно отметить, что значения основных популя­ционных параметров локуса HUMCD4 для иссле­дованной выборки оказались сходными с анало­гичными данными для некоторых других европео­идов [Kornienko I.V. e.a., 2002; Fernandes А. e.a., 2002]. Информа­тивность HUMCD4 для русских сравнима с тако­вой молекулярно-генетических маркеров LPL и D5S818 [Корниенко И.В. и др., 2002], но в разной степени уступает та­ким индивидуализирующим системам, как ТН01, vWA, D3S1358, D8S1179, D18S51, D13S317.

2. Изучение потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК в аспекте судебно-экспертного применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем HUMCD4, vWA и vWFII

При вероятностных расчетах в экспертных молекулярно-генетических приложениях по иденти­фикации личности и установлению родства популяционная частота встречаемости мультилокусного генотипа определяется как произведение соответ­ствующих частот для всех исследованных незави­симых локусов [Иванов П.Л., 1999; National Research Council of the USA, 1996].

Для правомерного использования правила пере­множения частот аллелей (генотипов) принципи­ально важным является соблюдение двух главных ус­ловий: 1) наблюдаемое распределение генотипов для каждого отдельного локуса в референтной по­пуляции должно соответствовать таковому, ожи­даемому из равновесия Харди-Вайнберга (РХВ); 2) анализируемые локусы должны быть генетиче­ски независимыми, т. е. не должно иметь место межлокусное неравновесие по сцеплению (НС).

Под НС понимают любую неслучайную ассо­циацию (взаимозависимость) между аллелями раз­ных локусов. Анализ НС используют при кар­тировании генов наследственных заболеваний, а также для выстраивания генетических маркеров от­носительно друг друга на хромосомных картах.

Для нейтральных локусов величина НС являет­ся своего рода мерой генетической дистанции, их разделяющей: обычно можно ожидать увеличения НС при уменьшении физической дистанции между маркерами, низких частотах рекомбинации и му­тирования. Из этого следует, что расположение маркерных локусов, близкое друг к другу на одном участке хромосомы, может рассматриваться как сигнал, указывающий на их возможную взаимозависимость. В случае выявления статистически значимого НС, правила перемножения частот для таких маркёрных локусов при судебно-экспертных вероятностных расчетах, неприемлемо.

В настоящей работе изучены параметры и даны оценки неравновесия по сцеплению для 4 микросателлитных локусов генома человека: LPL, CD4, vWA и vWFII, которые широко используют в формате мультилокусных панелей при иден­тификации личности в России и за рубежом. От­правным моментом для исследования послужило то обстоятельство, что CD4, vWA и vWFII распо­ложены относительно близко друг к другу - в теломерной области 12pter-12pl2 на коротком плече хромосомы 12, поэтому вопрос об их возможной взаимозависимости является актуальным. Для ло­куса LPL, расположенного на хромосоме 8, нет очевидных причин предполагать генетическую ас­социацию (сцепленность) с каким-либо из марке­ров хромосомы 12, поэтому он должен был играть роль отрицательного контроля на НС.

Исследованная выборка включала 92 неродст­венных человека, в отношении которых в РЦ СМЭ МЗ РФ проводились молекулярно-генетические эксперти­зы и исследования.

Наиболее информативным оказался локус vWA (таблица 6). Для него выявлено максимально описанное число аллелей - 8, тогда как для локусов CD4 и LPL ин­формативность оказалась приблизительно на од­ном уровне и при этом наименьшей (для обоих ло­кусов было выявлено по 5 аллелей). Это также со­гласуется с известными данными литературы.

Таблица 6

Распределение аллелей в исследованной выборке для 4 локусов

Аллель	Число наблюдений/частота
	LPL	CD4	vWFII	VWA
5		73/0,397
6		68/0,370
7
8
9	5/0,027		20/0,109
10	90/0,489	39/0,212	9/0,049
11	35/0,190	3/0,016	62/0,337
12	49/0,266	1/0,005	68/0,370
13	5/0,027		17/0,092	2/0,011
14			7/0,038	11/0,060
15			1/0,005	23/0,125
16				46/0,250
17				53/0,288
18				34/0,185
19				10/0,054
20				5/0,027

Для проверки исследуемых референтных выбо­рок на возможные отклонения от РХВ использова­ли точный (вероятностный) тест Фишера, что яв­ляется стандартной практикой для микросателлитных локусов [Maiste P. e.a., 1995; Zuliani G., 1990]. Наблюдав­шееся распределение генотипов для 4 исследован­ных локусов не отклонялось от РХВ.

Достоверное НС было выявлено только между локусами vWA и vWFII (таблица 7).

Таблица 7

Результаты попарного тестирования на НС исследованных локусов. В скобках указано число степеней свободы

Сравнительный анализ абсолютных зна­чений вероятностей, по­зволяет сделать вывод, что локус CD4 не обнару­живает НС с локусами vWA и vWFII, как и с локусом LPL. Для последнего также показано отсутст­вие НС со всеми остальными исследованными мар­керами. Отметим, что полученные результаты не про­тиворечат логике, построенной на относительной фи­зической локализации CD4, vWA и vWFII.

Следовательно, можно заключить, что при типировании локусов vWA и vWFII в составе одной многолокусной панели ввиду показанной в настоя­щей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (ге­нотипов) неприемлемо.

Таким образом, в настоящее время при вероят­ностных оценках результата типирования ПДАФ локусов vWA и vWFII возможно учитывать данные, полученные только для какого-нибудь одного (лю­бого) локуса из этой пары. В то же время совместное типирование локусов CD4, LPL и любого (но только одного) из иссле­дованных в настоящей работе локусов гена vWF можно проводить без каких-либо ограничений на правило перемножения частот аллелей или геноти­пов.

3.4. Популяционные аспекты экспертного применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем ПДАФ-типа

3.4.1. Распределение аллелей локуса D1S80 в выборке населения Российской Федерации

Анализ распреде­ления частот встречаемости аллелей локуса D1S80 в случайной (с точки зрения этнической принад­лежности и территориального происхождения образцов) проводился в популяционной выборке, состоящей из 225 человек, не являющихся кровными родственника­ми, из 56 регионов Российской Федерации.

В таблице 8 приведены частоты встречаемости алле­лей локуса DIS80 в исследованной популяционной выборке. Для сравнения показаны частоты аллелей для некоторых других расовых групп.

Как следует из полученных данных, распределе­ние частот встречаемости аллелей локуса D1S80 в исследованной российской популяции имеет наи­большее совпадение с распределением частот алле­лей у европеоидов, проживающих на территории США. Тем не менее, в российской выборке отме­чаются свои особенности. Так, в ней практически не встречаются генотипы, в которых присутствуют аллели 14, 15, 17, 19, 34, 38, 39, 40 и 41. С другой стороны, в российской (как и в японской) популя­ции аллель 16 встречается более часто, чем у белых американцев. Отметим, что эти различия носят минорный ха­рактер, и аналогичные результаты были получены при исследовании распределения аллельных частот у европеоидов Уральского региона России [Пушкарев В.П., Новиков П.И., 2001] и Среднего Поволжья [Пономаренко И.Б., 2004]. Общие тенденции распределения заметно различают­ся только у разных расовых групп.

Таблица 8

Частоты аллелей локуса D1S80 среди исследованной выборки в сравнении с некоторыми другими выборками (данные литературы)

	Российская выборка	Европеоиды США	Афро-американцы	Итальянцы	Греки-киприоты	Иорданцы	Евреи	Японцы
Аллель	n= 255	n= 7I8	n= 606	n= 141	n = 107	n = 215	n = 256	n = 222
< 14	__	__	__	__	—	0,002	—	—
14	—	—	—	—	—	0,002	—	—
15	—	—	—	—	—	0,0	—	—
16	0,014	0,001	0,002	—	—	0,002	0,002	0,0225
17	0,0	0,002	0,028	—	0,014	0,0	0,0	0,0315
I8	0,261	0,237	0,073	0,223	0,178	0,161	0,205	0,1757
19	0,0	0,003	0,003	0,007	0,014	0,002	0,002	0,0135
20	0,027	0,018	0,032	0,010	0,005	0,012	0,014	0,0225
21	0,017	0,021	0,115	0,056	0,037	0,044	0.037	0,009
22	0,063	0,038	0,081	0,070	0.079	0,051	0,035	0,009
23	0,006	0,012	0,014	0,010	0,005	0,016	0.008	0,0
24	0,339	0,378	0,234	0,368	0,393	0,388	0,473	0,2432
25	0,051	0,046	0,045	0,028	0,051	0,035	0,070	0.0045
26	0,010	0,020	0,006	0,010	0,019	0.023	0,014	0,0045
27	0,006	0,007	0,008	0.014	0,056	0,005	0,010	0,072
28	0,055	0,063	0,130	0,049	0,075	0,070	0,055	0,0946
29	0,041	0,052	0,053	0,085	0,042	0,058	0,014	0,054
30	0,010	0,008	0,009	0,028	0,014	0,005	0,002	0,1171
31	0,074	0.072	0,054	0,021	0,019	0,056	0,039	0,045
32	0,002	0,006	0,007	0,0	—	0,014	0,014	0,0135
33	0,002	0,003	0,004	0,007	—	0,0	0,0	0,0045
34	0,0	0.001	0,086	0,007	—	0,009	0,004	0,0045
35	0,004	0,003	0,002	—	—	0,002	0.002	0,0
36	0,012	0,004	0,001	—	—	0,005	0,0	0,009
37	0,006	0,001	0,0	—	—	0,007	0,002	0,0135
38	—	0,0	0,0	—	—	0,0	—	0,0
39	—	0,003	0,003	—	—	0,002	—	0,009
40	—	0,0	0,0	—	—	0,0	—	0,0
41	—	0,0	0,002	—	—	0,0	—	0,0045
>41	—	0,001	0,007	—	—	0,028	—	0,0225

Таблица 9

Основные популяционные характеристики локуса D1S80

Вероятность случайного совпадения	0,068
Дискриминирующий потенциал	0,932
Индекс полиморфизма	0,77
Потенциал исключения	0,472
Усредненный индекс отцовства	1,83
Наблюдаемая гомозиготность	0,273
Ожидаемая гомозиготность	0,196
Генетическое разнообразие	0,802

3.4.2. Исследование аллельного полиморфизма молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе тетрануклеотидных тандемных повторов LPL, vWA и TH01 среди населения России

В настоящей работе проведено систематизиро­ванное исследование распределения аллелей ло­кусов LPL, vWA и ТН01 среди 442 человек, не являющихся кровными родственниками из 57 регионов России с целью уточнения базо­вых оценочных характеристик локусов и повышения эффе­ктивности экспертного применения индивидуали­зирующих систем. Для аллелей изученных локусов размер амплифицирован­ных фрагментов ДНК находится в диапазоне 105-203 п.н., что позволяет эффективно использовать их даже в случаях сильно деградированных препа­ратов матричной ДНК.

До недавнего времени базы данных по частотам встречаемости аллелей локусов системы LPL, vWA и ТН01 для популяций России отсутст­вовали или были фрагментарными. С целью получения этих характеристик для популяции нашей страны мы провели масштабное исследование распределения аллелей указанных локусов.

Таблица 10

Частоты аллелей локусов LPL, vWA и ТН01 среди населения РФ

Таблица 11

Значения основных популяционных характеристик локусов LPL, vWA и ТН01 для населения РФ

Как следует из полученных данных (таблица 11), из трех иссле­дованных STR-локусов наиболее информативным является локус vWA (вероятность случайного сов­падения генотипов 0,062, вероятность исключения ложно указанного отцовства 0,564). При совместном типировании изученных трех ло­кусов вероятность случайного совпадения геноти­пов уменьшается до величины 0,000824, что соот­ветствует 1:1214.

При сравнительном анализе распределения частот встречаемости аллелей в локусах vWA и ТН01, исследованных в российской выборке в настоящей работе с распределением частот в других популяционных выборках, наблюдалось характерное сходство в доминировании частот у европеоидов, проживающих на территории США [Appleid Biosystems, 2003], у европеоидов Уральского региона России [Пушкарев В.П., 2006].

Выводы

1. В отличие от человека, у исследованных в настоящей работе животных, ген амелогенина не обладает половым диморфизмом и потому не может служить пол-специфическим маркером. Тем не менее, амелогениновый ДНК-тест определения биологического пола не является абсолютно видоспецифичным для человека. Это означает, что при судебно-экспертном типировании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК (домашних) животных, возможно получение «нетипичных» амплификационных продуктов, искажающих истинный результат.
2. Установлено, что при использовании амелогенинового ДНК-теста, при определенных условиях, в биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола человека. Кроме этого, при судебно-экспертном типировании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК животных, существует опасность ложного определения мужского пола в следах женского происхождения. Этому может способствовать неправильно подобранный стандарт молекулярных масс, его удаленное расположение на геле или использование неточного расчетного алгоритма для определения размеров анализируемых фрагментов.
3. Показано, что если нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой ДНК и стандартной ДНК (стандарта молекулярных масс) оказываются различными (такие ДНК называют гетерологичными), то в определении размеров фрагментов и, соответственно, в идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов ДНК могут быть допущены серьезные ошибки, обусловленные различиями в физико-химических, и, как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом. Это явление наиболее сильно выражено в случае использования в качестве электрофоретической среды разделения ПААГ и в несколько меньшей степени при электрофоретическом фракционировании в гелях агарозы.
4. Уточнена структурная организация аллелей полиморфных локусов хромосомной ДНК человека D1S111 и HUMCD4, и разрешены противоречия в этом вопросе, имеющиеся в литературных источниках. Это снимает ограничения на возможность сравнения результатов экспертиз, полученных в разных лабораториях при применении этих молекулярно-генетических маркеров, а также позволяет использовать эти результаты при формировании референтных баз данных.
5. Установлено достоверное неравновесие по сцеплению между локусами vWA и vWFII. Это означает, что при типировании локусов vWA и vWFII в составе одной многолокусной панели, ввиду показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) неприемлемо.
6. Определены основные популяционные характеристики полиморфизма (аллельного разнообразия) локусов хромосомной ДНК человека: D1S111, D1S80, HUMCD4, LPL, vWA и TH01 в исследованной выборке населения России.

 

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При молекулярно-генетическом анализе пол-специфических вариантов гена амелогенина, для того, чтобы избежать опасности ложного типирования пола человека в препаратах, содержащих ДНК животных, необходимо правильно подобрать стандарт молекулярных масс, не допускать его удаленного расположения на геле и использовать для определения размеров амплифицированных фрагментов ДНК точный расчетный алгоритм. В случае получения "нетипичных" продуктов амплификации в исследуемых препаратах ДНК, необходимо провести дополнительное исследование исходных биологических объектов для верификации их видовой принадлежности.
2. Для корректного определения размеров анализируемых фрагментов и идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов, ДНК, применяемая в качестве стандарта молекулярных масс, должна быть гомологична анализируемой ДНК, то есть иметь одинаковые с ней нуклеотидный состав и первичную структуру. Определение размеров фрагментов ДНК по гетерологичным стандартам молекулярных масс нежелательно при использовании электрофоретического фракционирования в гелях агарозы, и категорически противопоказано в случае использования в качестве среды разделения ПААГ. Отметим, что для гелей агарозы это в принципе возможно, но как минимум, требует использования специальных гелевых сред и введения в анализ дополнительного контрольного образца ДНК с заранее известным генотипом по каждому исследуемому локусу. Но даже в этом последнем случае, важно понимать, что генотипические характери­стики, получаемые расчетным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетеро­логичных стандартов молекулярных масс, являются не абсолютными, а относительными (условными) и потому не могут быть напрямую использованы как элементы банка данных.
3. Номенклатуру аллельных вариантов локуса HUMCD4 следует унифицировать. На основании полученных в настоящей работе результатов, считаем целесообразным в качестве стандарта для локуса HUMCD4 принять номенк­латуру, основанную на нумерации повторяющихся тандемных повторов по "верхней" цепи матричной ДНК.
4. При типировании локусов vWA и vWFII в составе одной многолокусной панели, по причине показанной в настоя­щей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (ге­нотипов) для них неприемлемо. Таким образом, при вероят­ностных оценках результата типирования ПДАФ локусов vWA и vWFII возможно учитывать данные, полученные только для какого-нибудь одного (лю­бого) локуса из этой пары. В то же время совместное типирование локусов CD4, LPL и любого (но только одного) из иссле­дованных в настоящей работе локусов гена vWF можно проводить без каких-либо ограничений на правило перемножения частот аллелей или генотипов.
5. Полученные в настоящей работе характеристические данные о распределении аллелей исследованных полиморфных локусов хромосомной ДНК среди российского населения могут быть использованы для получения референтных данных для вычисления необходимых расчётных параметров при интерпретации результатов судебно-экспертных молекулярно-генетических идентификационных экспертиз и исследований и создании банков генетической информации.

 

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Е.Ю.Земскова, П.Л.Иванов. Изучение свойств гетерологичных маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК. Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской службы РФ. 5 Всероссийский съезд судебных медиков. Астрахань, 28-30 августа 2000г., с. 244-246.
2. И.В. Корниенко, Е.Ю. Земскова, С.А. Фролова, В.В. Якушев, П.Л. Иванов. Исследование аллельного полиморфизма молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе тетрануклеотидных тандемных повторов LPL, vWA и TH01 среди населения России. Судебно-медицинская экспертиза, 2002, № 5, с.12-15.
3. П.Л. Иванов, Е.Ю. Земскова, Т.А. Тарасова, С.А. Фролова, Л.С. Михалкович, И.В. Корниенко. Опыт использования FTA-носителей для хранения образцов крови при проведении молекулярно-генетических идентификационных исследований неопознанных погибших - жертв военных действий на территории Чеченской Республики. Судебно-медицинская экспертиза, 2002, № 6, с. 20-27.
4. И.В. Корниенко, Е.В.Щербакова, Е.Ю.Земскова, П.Л.Иванов. Распределение аллелей локуса D1S80 в случайной выборке населения Российской Федерации. Судебно-медицинская экспертиза, 2002, № 6, с. 27-31.
5. Е.Ю. Земскова, С.А. Фролова, Ж.В. Слепцова, П.Л. Иванов. Изучение видовой специфичности амелогениновой системы установления генетического пола. Судебно-медицинская экспертиза, 2003, № 4, с. 20-25.
6. Е.Ю. Земскова, С.А. Фролова, Ж.В. Слепцова, П.Л. Иванов. О видоспецифичности амелогенинового теста на половую принадлежность ДНК. Актуальные проблемы судебной медицины. Сборник научных трудов РЦСМЭ МЗ РФ, Москва, 2003, с. 262-266.
7. И.В. Корниенко, В.В. Якушев, С.А. Фролова, Е.Ю. Земскова, Н.П. Кабанова, П.Л.Иванов. Некоторые результаты использования молекулярно-генетических маркеров хромосомной ДНК для идентификации неопознанных останков военнослужащих, погибших в ходе боевых действий на Северном Кавказе. Судебно-медицинская экспертиза, 2003, № 5, с.36-41.

8. П.Л. Иванов, Е.Ю. Земскова, Н.Н. Лебедева, И.А. Eфремов. Уточнение номенклатуры аллелей и характеристика аллельного полиморфизма молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе пентануклеотидного тандемного повтора HUMCD4. Судебно-медицинская экспертиза, 2004, № 4, с. 33-38.

9. П.Л.Иванов, Р.И. Tуракулов, Е.Ю. Земскова, И.А. Eфремов. Изучение потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК в аспекте судебно-экспертного применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем CD4, vWA и vWFII. Судебно-медицинская экспертиза, 2005, № 2, с. 29-35.

10. И.А. Eфремов, Н.Н. Лебедева, Е.Ю. Земскова, П.Л. Иванов. Характеристика молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе минисателлитного маркера D1S111. Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики - Материалы VI всероссийского съезда судебных медиков, 6-8 сентября 2005г., Москва-Тюмень, «Академия», с. 97-99.

11. И.А. Eфремов, Н.Н. Лебедева, Е.Ю. Земскова, П.Л. Иванов. Изучение свойств молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе хромосомного локуса D1S111 в аспекте судебно-экспертного типирования ДНК. Судебно-медицинская экспертиза, 2005, № 5, с. 29-33.