Установление HBsAg в пятнах крови на вещественных доказательствах методом твердофазного иммуноферментного анализа. Методические рекомендации

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

125284 Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13;

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ «БЮРО СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»

355000, Ставрополь, ул. Дзержинского, 70.

«Утверждаю»
И.о. директора ФГБУ «РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России,
доктор медицинских наук
А.В. Ковалев

/    29 марта 2012 г.

Установление HBsAg  в пятнах крови на вещественных доказательствах методом твердофазного иммуноферментного анализа

(Методические рекомендации)

Москва 2012

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время, благодаря развитию иммуногенетики, гематологии, биохимии и ряда других теоретических дисцип­лин, судебно-медицинская экспертиза крови получила возмож­ность пополнить систему признаков, используемых для решения задач идентификации личности. В связи с этим перспективно использование маркеров, приобретенных организмом в процессе жизни (антигенов, антител). В качестве одного из них может быть использован сывороточный антиген гепатита В (HBsAg).

В России в последние годы заболеваемость гепатитом В имеет устойчивую тенденцию к росту как по количеству забо­левших, так и выявленных носителей. Заболеваемость острым гепатитом В (регистрируются практически только желтушные формы заболевания) в последние 20 лет возросла более чем в три раза, достигнув в 1997 году 36,3 на 100 тыс. населения. Для сравнения показатели заболеваемости гепатитом В в странах Скандинавии, Ирландии и Великобритании менее 1, а в Герма­нии, Франции, Италии - 3-5 на 100 тыс. Средний уровень носительства вируса гепатита В в нашей стране составляет 2,7%. По данным Госкомсанэпиднадзора, только за последние 2 года чис­ло заболевших острой формой гепатита В составило 105128 че­ловек, было зарегистрировано 247245 новых вирусоносителей, большинство из которых имеет серьезную патологию печени.

Развитие методов иммуноферментного анализа определило возможность установления HBsAg не только в жидкой крови, но и в пятнах крови на вещественных доказательствах. Нами был разработана новая медицинская технология для опре­деления HBsAg в пятнах крови методом твердофазного имму­ноферментного анализа с использованием отечественного набо­ра реагентов производства НПО «Диагностические системы». Принцип метода заключается в том, что в результате количест­венного твердофазного ИФА образуется специфический иммун­ный комплекс, состоящий из иммобилизованных на поверхно­сти лунок полистирольного планшета антител к HBsAg, содер­жащегося в исследуемом материале HBsAg и антител, меченых пероксидазой хрена. Данный комплекс выявляется посредством окраски с помощью раствора тетраметилбензидина, после чего в лунки полистирольного планшета вносят стоп-реагент. Регист­рация результатов реакции осуществляется фотометрически на регистрирующем приборе при длине волны 450 нм с последую­щим вычислением критической оптической плотности.

Аналогов данного метода по выявлению HBsAg в пятнах крови за рубежом не имеется.

Показания к использованию

В связи с тем, что HBsAg в крови практически здоровых людей встречается сравнительно редко (1-4%), его можно отне­сти к числу «особых примет» - признаков, индивидуализирующих личность. Эта особенность HBsAg при использовании в практике судебно-медицинской экспертизы позволяет конкрети­зировать происхождение крови на вещественных доказательст­вах от лиц, проходящих по делу и ограничить число подозре­ваемых при обработке следственных версий.

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

Используют оборудование и реактивы, стандартные для судебно-биологических отделений бюро судебно-медицинской экспертизы, а также:

Набор реагентов дли иммуноферментного определения поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке крови человека «ДС-ИФА-Н BsAg-0,01» НПО «Диагностические системы» по ТУ 9398-091-05941003-2006 (Паспорт 2198, регистрационное удостоверение ФСР № 2006/03019), используемый в клинической практике для установления инфицирования вирусом гепатита В.

Промыватель (вошер от англ. wash - мыть) медицинский микропланшетный фирмы «Sanofi Dagnostics Pasteur» PW40 (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/211 от 28.02.2003 г.); ридер (от англ. read - читать, считывать) «Sanofi Dagnostics Pasteur» PR2100 (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/211 от 28.02.2003 г.) и инкубатор для микропланшет IPS-2 той же фирмы (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/211 от 28.02.2003 г.).

Ридер (от англ. read - читать, считывать) фотометр для микропланшетов «Zemfira» фирмы «Bio-RAD Laboratories. Inc., США» с принадлежностями (Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития ФС №2006/1979 от 12.12.2006 г.).

ОПИСАНИЕ

Пробоподготовка образцов

После установления наличия и видовой принадлежности крови вырезают фрагмент из объекта размерами 0,5x0,5 см, либо несколько вырезок из участка размерами 10x10 см (в зависимости от тактики экспертного исследования, характера и величины следов. Исследуемый материал заливают минимальным необходимым (без избытка) объемом физиологического раствора. Экстрагируют при температуре 4° С от 18 до 24 часов. Возможно использование приготовленной ранее для установления наличия и видовой принадлежности крови вытяжки из следов крови.

Ход работы

Данный метод реализовывался в следующей последова­тельности действий (рис. 1):

• - промывание перед использованием  полистиролового планшета фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с рН 7,2-7,4 3 раза на вошере (либо вручную) и полное удаление жидкости;
• - внесение в лунки полистиролового планшета по 100 мкл исследуемых и контрольных (отрицательной, положительной, слабоположительной) проб;
• - инкубация в течение 30 минут в термостате при температуре +42±0,5°С;
• - не удаляя содержимого лунок, внесение в лунки полистиролового планшета по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-1 (моноклональные антитела к HBsAg, конъюгированные с биотином);
• - инкубация в течение 40 минут на термостатируемом шейкере при температуре +42°С (интенсивность перемешивания 500 об/мин);
• - не удаляя содержимого лунок, внесение в лунки полистиролового планшета по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-2 (стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена);
• -  инкубация в течение 20 минут на термостатируемом шейкере при температуре +42°С (интенсивность перемешивания 500 об/мин);
• - промывание фосфатно-солевым буфером (ФСБ) 7 раз на вошере (либо вручную) и полное удаление жидкости;
• - внесение в лунки полистиролового планшета по 150 мкл субстратной смеси (готовится непосредственно перед использованием путем разведения тетраметилбензидина (ТМБ), который представляет собой бесцветную жидкость на основе стабилизированного буферного раствора, содержащего 3,3 г, 5,5 г - тетраметилбензидина гидрохлорида, субстратным буферным раствором - цитратным буфером, содержащим раствор перекиси водорода);
• - инкубация 25 минут при температуре от +18°С до +24°С в защищенном от света месте;
• - внесение в лунки полистиролового планшета по 50 мкл стоп-реагента (1Н соляная кислота);
• - регистрация результатов реакции фотометрически на ридере при длине волны 450 нм с введением результатов в компьютер;
• - распечатка результатов с помощью принтера.

Оценка результатов

Компьютерную программу для ридера (программное обеспечение продается вместе с прибором, под каждый тест-набор пользователь сам или с помощью инженера-программиста составляет программу, исходя из инструкции к нему) следует написать так, чтобы отсечка шла от критической оптической плотности. Реакцию следует учитывать, если значение оптической плотности в лунках с положительным контролем не менее 0,6, а среднее значение в лунках с отрицательным контролем - не более 0,12.

Положительными считаются образцы со значениями оп­тической плотности, равными или превышающими критическую оптическую плотность, которая рассчитывается по формуле:

ОП крит. = ОП К'ср. + 0,06,

где 0,06 - коэффициент, определяемый методом стати­стической обработки результатов постановки ИФА на предприятии-изготовителе.

Контрольный слабоположительный образец, содержащий HBsAg в концентрации 0,02±0,01 МЕ/мл, должен давать положительную реакцию.

Исследуемые образцы расцениваются как отрицательные,  если ОП образца < ОП крит.

Исследуемые образцы расцениваются как положительные, если ОП образца > ОП крит.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА

Эффективность использования метода заключается, прежде всего, в повышении качества судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств. Так, выявление в следах крови НЬ8А§ позволяет значительно повысить дифференцирующие возможности экспертизы.

Метод апробирован на заведомых образцах крови от 100 но­сителей HBsAg, высушенных на марле, при этом было исследовано около 500 объектов. Чувствительность реакции обнаружения HBsAg - 4x10 ⁶ мл крови, при этом ложноположительных и ложно-отрицательных результатов зарегистрировано не было. HBsAg был обнаружен во всех исследованных пятнах крови, независимо от давности их образования. HBsAg не был обнаружен в пятнах крови лиц контрольной группы, а также в вытяжках из предмета-носителя.

Метод обладает рядом существенных преимуществ:

1. Высокая чувствительность и специфичность в сочетании с объективной регистрацией и возможностью компьютерной   обработки результатов. Документирование   результатов ИФА в табличной форме позволяет дополнительно иллюстрировать заключения экспертов.
2. Высокая воспроизводимость.
3. Воздействие на кровь высокой температуры, прямых солнечных лучей, нахождение крови на снегу и почве, гемолиз не отражаются на результатах обнаружения НВsАg.