Применение молекулярного спектрального анализа для идентификации некоторых видов грибов

Судебномедицинская диагностика отравлений грибами весьма затруднительна. Морфологический анализ грибных остатков, поступающих к судебномедицинскому эксперту, не всегда выполним вследствие резких изменений грибной ткани, возникающих в процессе кулинарной обработки и переваривания.

Из других методов, используемых для видовой идентификации грибов в пищевой гигиене и микологии, следует отметить флуоресцентный анализ и химические цветные реакции, описанные в монографии Н. И. Орлова, а также зарубежных авторов. Широкое внедрение этих методов в судебномедицинскую практику осложняется тем, что грибы поступают ка исследование измененными настолько, что использование химических цветных реакций и флуоресцентного анализа весьма затруднено.

Возможность использования хроматографического анализа для определения грибов рода Amanita показали американские исследователи, применившие этот метод для идентификации свежих грибов.

Мы попытались воспользоваться молекулярным анализом по электронным спектрам поглощения в ультрафиолетовой области.

Как известно, спектр поглощения любого вещества, определяемый его молекулярным строением, крайне индивидуален и в принципе неповторим. Для целей идентификации находят кривую поглощения неизвестного вещества, которая совпала бы с кривой поглощения известного вещества по наличию в сравниваемых кривых максимумов и минимумов при определенных длинах волн.

При этом используется спектрофотометрический метод, сущность которого состоит в определении оптической плотности изучаемого раствора как функции длины волны. Если J₀ — интенсивность света, падающего на раствор поглощающего вещества, J — интенсивность света, выходящего из раствора поглощающего вещества, то оптическая плотность D определяется следующим образом:

D = lg (J₀/J)

Если кривые поглощения сравниваемых объектов построены в координатах lgD, λ, то сходство и различия их спектров легко устанавливаются. Действительно, если прологарифмировать выражение закона Бугера, связывающего поглощение света с концентрацией поглощающего вещества:

D = k, d, c

где D — оптическая плотность,k —коэффициент поглощения, d — толщина поглощающего слоя, c —концентрация поглощающего вещества, то получим:

lgD = lgk + lgd + lgc

Так как логарифм d и логарифм c от длины волны не зависят, то кривые, построенные в координатах LgD, λ и измеренные при различных d и с, будут сдвинуты по отношению друг к другу на постоянную величину, равную

lgD₁ - lgD₂ = (lgd₁ - lgd₂)+(lgc₁-lgc₂)

 На этом свойстве кривых поглощения, построенных в координатах IgD λ, и основан наиболее удобный метод отождествления веществ по их спектрам поглощения. Кривые наносятся на прозрачную бумагу, накладываются друг на друга и перемещаются по вертикали, что устраняет влияние различия в концентрациях поглощающих веществ. Совпадение кривых поглощения свидетельствует об идентичности сравниваемых объектов.

Наши исследования производились на кварцевом фотоэлектронном спектрофотометре СФ-4 (спектральная область от 220 до 1100 mμ), на котором измеряется пропускание (в процентах) и оптическая плотность образца относительно эталона, пропускание которого принимается за 100, а оптическая плотность, равной нулю. На пути света определенной длины волны, выходящего из монохроматора, поочередно устанавливались эталон и измеряемый образец. Отношение светового потока, прошедшего через образец, к световому потоку вне образца определялось по шкале пропускания отсчетного потенциометра.

Исследованию были подвергнуты грибы 3 групп:

• 1) бледные поганки (ядовитые бледная поганка и мухомор поганковидный) и морфологически сходные с ними съедобные «двойники» — зеленушка и шампиньон обыкновенный;
• 2) красные мухоморы (ядовитый красный мухомор) и сходный с ними морфологически колпак кольчатый;
• 3) строчки (строчок обыкновенный) и сморчок настоящий.

Кроме того, для исследования был взят опенок осенний, напоминающий в отдельных случаях грибы группы бледной поганки.

Для получения электронных спектров грибов приготовлялись их водно-спиртовые вытяжки. От каждого гриба брали по 1 г ткани (по 0,5 г от шляпки и ножки), заливали 20 мл 70% этилового спирта и выдерживали в течение суток при 30°. Полученные вытяжки отфильтровывали.

Электронные спектры поглощения грибных вытяжек были получены в спектральном интервале от 240 до 300 mμ. Толщина поглощающего слоя составляла от 0,1 до 1 мм. По измеренным значениям оптических плотностей строились кривые поглощения в координатах lgD , λ. При построении кривых было обнаружено, что наибольшие различия между кривыми поглощения грибных вытяжек лежат в диапазоне длин волн от 240 д о 280 mμ.

Особое внимание уделялось сопоставлению кривых поглощения грибов-«двойников», входящих в перечисленные выше 3 группы.

На рис. 1 изображены кривые поглощения вытяжек ядовитых бледной поганки и поганковидного мухомора и съедобных «двойников» — зеленушки и шампиньона. Здесь же приведен спектр опенка осеннего. Как видно из рис. 1, кривая поглощения вытяжки каждого гриба характеризуется своей индивидуальной формой. Кривая поглощения бледной поганки не имеет ясно выраженных максимумов и минимумов поглощения, что выделяет этот вид из всех грибов данной группы. Кривая мухомора поганковидного характеризуется отчетливо выраженным симметричным пиком поглощения с максимумом в области 270 mμ, что резко отличает его от бледной поганки. Спектры поглощения зеленушки и шампиньона имеют максимум поглощения в области 260—265 mμ, который несколько смещен в длинноволновую область у зеленушки и менее четко выражен у шампиньона. Весьма характерный спектр поглощения с максимумом в области 260 mμ и меет опенок осенний.

На рис. 2 изображены кривые поглощения вытяжек ядовитого красного мухомора и съедобного колпака кольчатого. В области 250—280 mμ кривая красного мухомора имеет широкий пик поглощения в отличие

от колпака кольчатого, который максимума не имеет, но характеризуется наличием в этой области участка почти горизонтального направления.

На рис. 3 изображены кривые поглощения вытяжек строчка обыкновенного, могущего вызвать тяжелые отравления, и съедобного сморчка настоящего. Кривая сморчка в области 240—280 mμ , максимумов и минимумов поглощения не обнаруживает. Кривая строчка характеризуется наличием в области 240—260 mμ , горизонтального участка почти равного поглощения. Кривые двух строчков разных мест сбора обнаруживают значительное совпадение.

Как видно из рис. 1—3, кривые поглощения различных грибов отличаются разнообразием формы и индивидуальностью. Это обстоятельство можно использовать для идентификации в том случае, если стадия развития и место сбора грибов не оказывают существенного влияния на форму и характер кривой поглощения.

С целью проверки мы поставили специальные опыты. По описанной выше методике приготовили 5 водно-спиртовых вытяжек красного мухомора различных мест сбора и стадий развития.

Исследовались вытяжки высушенных экземпляров красного мухомора:

1. Молодой гриб, сбор 1957 г., Московская область.
2. Молодой гриб, сбор 1957 г., Владимирская область.
3. Зрелый гриб, сбор 1958 г., Горьковская область.
4. Зрелый гриб, сбор 1959 г., Горьковская область".
5. Перезрелый гриб, сбор 1959 г., Горьковская область.

Для получения спектров использовалось не более 1 мл приготовленных водно-спиртовых вытяжек. Таким образом, для проведения исследования достаточно 0, 005—0,1 г грибной ткани.

Электронные спектры поглощения вытяжек красного мухомора были получены в условиях, аналогичных описанным выше. На рис. 4 изображены кривые поглощения водно-спиртовых вытяжек 5 экземпляров этого гриба.

Исследовались вытяжки высушенных экземпляров красного мухо-... (???)

мест сбора и стадий развития показывает значительное совпадение их по форме и характеру. Кривые характеризуются общим для них широким пиком поглощения с максимумом в области 250—260 mμ. В области 260—300 тр, кривые обнаруживают сильное падение интенсивностей со слабовыраженным перегибом в области 280—290 mμ.

Выводы

1. На основании произведенных при помощи спектрофотометра СФ-4 исследований установлено, что водно-спиртовые вытяжки из грибов — бледная поганка, мухомор поганковидный, зеленушка, шампиньон обыкновенный, опенок осенний, красный мухомор, колпак кольчатый, строчок обыкновенный и сморчок настоящий — имеют характерные спектры поглощения в области 240—300 mμ.
2. Спектры ядовитых грибов отличаются от спектров их съедобных «двойников».
3. На примере красного мухомора видно, что характер спектра качественно не меняется в зависимости от места сбора и возраста грибов.
4. Молекулярный анализ по спектрам поглощения в ультрафиолетовой области является перспективным методом в судебномедицинской экспертизе грибных отравлений.