О возможности применения в судебно-медицинской экспертизе сывороточных ГАММА-глобулиновых факторов Gm

С 1956 г. началось изучение сывороточных группоспецифических факторов, связанных с ГАММА-глобулином и поэтому названных Gm. В настоящее время выделяют 11 ГАММА-глобулиновых факторов:     Gm (a), Gm (b), Gm (х), Gm(c) (Gm — like), Gm (d), Gm (e), Gm (f), Gm (r), InV (a), InV (b), InV (1). Эти факторы постепенно находят применение в судебно-медицинской практике. В ряде зарубежных стран свойства Gm (a), Gm (b), Gm (х) и других факторов используют в экспертизах по делам о спорном отцовстве, материнстве и замене детей. Проведенными многочисленными посемейными обследованиями показана наследственная передача ГАММА-глобулиновых факторов по правилам доминантного признака. Процент исключения отцовства при использовании лишь факторов Gm (а, b, х) составляет 21—27.

Большой интерес для судебных медиков представляют сообщения о возможности установления Gm-групп в пятнах крови. В частности, факторы Gm (а) и Gm (х) и вытяжках успешно определяли на плексигласовых пластинках с дорожками по методике, разработанной Funfhausen для жидкой крови. Hunger и Gohler в кровяных пятнах полугодовой давности, находившихся на различных предметах-носителях и хранившихся в условиях меняющейся внешней температуры, солнечного облучения и естественного запыления, успешно выявляли не только факторы Gm (а) и Gm (х), но и Gm (b) и InV (а).

Некоторые исследователи определяли Gm-группы в пятнах крови по методу абсорбции антител анти-Gm (Funfhausen с соавторами; Prokop и Bundschuh).

По данным Funfhausen с соавторами, в пятнах крови, подвергшихся таким видам внешних воздействий, как нагревание в термостате до 120° в течение 1 часа, облучение ультрафиолетовыми лучами в течение 10 часов, 3-часовое воздействие ультразвуком, кратковременная обработка крови мылом, удавалось отчетливо установить Gm-группу сухой крови. Nielsen и Henningsen пятна крови на различных текстильных тканях выдерживали в течение 2,5 и 11 недель в сухом и сыром помещении при комнатной температуре и в условиях термостата при 37°. Gm-группы определяли количественным методом через титрацию вытяжек из пятен крови. Все исследования проводили слепо и сравнивали с Gm-группой донора. Ни в одном случае не было получено ложных результатов.

С целью определения стойкости фактора Gm (а) в сухой крови при различных сроках хранения и к различным воздействиям мы провели экспериментальные исследования. Стандартная сыворотка анти-Gm была нам любезно предоставлена директором Берлинского института судебной медицины Гумбольдтского университета проф. Prokop. Устойчивость фактора Gm(a) при хранении пятен крови. I серию опытов провели с разведениями вытяжек из пятен и корочек сухой крови. Всего использовали 8 экспериментальных пятен крови от различных людей, 6 из которых Gm (а +) и 2 Gm (а—), и сухую кровь 1 человека группы Gm (а + ), высушенную в чашке Петри. Предметами-носителями для пятен крови служили: медицинская марля, хлопчатобумажный сатин, хлопчатобумажная белая бельевая ткань, хлопчатобумажный габардин от армейского обмундирования. Все ткани, за исключением медицинской марли, были в употреблении. Сатин и бельевой материал хорошо смачивались и пропитывались кровью, хлопчатобумажный габардин обладал плохой всасывающей способностью, на поверхности его оставались корки засохшей крови. Пятна высушивали в течение 1 суток при комнатной температуре, в последующем их хранили в комнате, в шкафу при 18—20°.

Испытуемый материал исследовали через 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15 и 30 суток после его приготовления, а в последующем при хранении в течение 3, 6, 9 и 12 месяцев. Вытяжки приготовляли из расчета 20 мг материала пятна и 0, 2 мл физиологического раствора. Навески для экстрагирования преимущественно выбирали из центральных участков пятна, экстрагировали 24 часа в холодильнике при 4°. Полученные вытяжки разводили физиологическим раствором в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 раз, а затем в разведениях вытяжек на плексигласовых пластинках определяли фактор Gm(a) ¹.

Изменения фактора Gm(a) в пятнах крови на протяжении 12-месячного наблюдения не установлено. Колебания ГАММА-глобулинового свойства в разведениях вытяжек из пятен, достигавшие иногда 2—3 ступеней, по-видимому, объясняются различным количеством сывороточного белка, оказавшегося в навеске материала пятна, взятого для экстрагирования. Корки крови, высушенные в чашке Петри, для всех этапов исследования были заранее одномоментно приготовлены по 20 мг из одного участка и в течение всего периода хранились в пробирках. В этих навесках достигнуто более равномерное распределение сывороточного белка, поэтому вытяжки из корок сухой крови показали почти одинаковую тормозную способность.

II серия опытов выполнена с 18 пятнами крови от различных доноров, но вытяжки из этих пятен не титровали. В 12 объектах из 18 кровь относилась к Gm(a + ) и в 6 — к Gm(a—). Предметами-носителями служили: медицинская марля, шинельное сукно, грубошерстное шинельное сукно, полушерстяная диагоналевая ткань, шерстяной трикотаж, байка, трикотаж с начесом, искусственный шелк, хлопчатобумажная бельевая ткань. Медицинскую марлю брали новую, а остальные ткани были в употреблении. При экстрагировании пятен применяли соотношения: пятна на марле — 20 мг материала и 0,2 мл физиологического раствора, пятна на остальных предметах-носителях — 50 мг материала и 0,3 мл физиологического раствора. Исследование Gm проводили через 1, 3, 7, 15 и 30 суток, 3, 6, 9 и 12 месяцев после приготовления пятен. В течение всего периода наблюдения пятна хранили в шкафу при комнатной температуре. Предметы-носители не влияли на ход реакции. Вытяжки из пятен крови группы Gm(a + ) независимо от сроков хранения показывали стойкую тормозную реакцию. Вытяжки из пятен крови группы Gm(a—) не нарушали агглютинации сенсибилизированных эритроцитов.

Исследовали также пятна крови на различной одежде, поступившей на экспертизу в 1958—1962 гг., хранившейся в течение 1—5 лет в неотапливаемом пыльном чердачном помещении с колебаниями температуры от +30° до —15°. Gm-группа крови в пятнах заранее не была известна. Наши исследования имели бы положительное значение лишь при обнаружении ГАММА-глобулинового фактора в сочетании с отрицательными результатами реакций на наличие Gm-антигена. Интенсивность и пропитывание ткани кровью были различными, наряду с хорошо выраженными пятнами встречались и мало заметные. Всего исследовали 22 объекта. Предметами-носителями в основном служил тот же материал, что и в предыдущих опытах. Для экстрагирования применяли 50 мг материала и 0,3 мл физиологического раствора. Вытяжки из всех предметов-носителей без пятен крови не влияли на ход реакции. Кровь в 6 объектах из 22 испытанных образцов содержала фактор Gm(a). По срокам хранения последние пятна распределялись следующим образом: 1 объект — 5 лет, 3 объекта — 4 года, 1 объект — 3 года, 1 объект — 1 год. Вытяжки из указанных объектов были неинтенсивно окрашены в желтый цвет, прозрачные; проба Геллера — резко положительной. Судя по цвету вытяжек, в описываемых пятнах, по-видимому, произошел глубокий распад гемоглобина, однако сывороточные белки сохранили свои свойства и относительно легко переходили в раствор. С остальными вытяжками проба Геллера была также резко положительной, за исключением вытяжек из 2 пятен, которые после 2-суточного экстрагирования оставались бесцветными, а на границе соприкосновения этих вытяжек с концентрированной азотной кислотой отмечался лишь едва различимый осадок белка.

Результаты проведенных опытов позволяют утверждать, что даже длительное хранение пятен крови не препятствует определению фактора Gm(a).

Определение фактора Gm(a) в пятнах, подвергшихся различным видам внешнего воздействия. По 20 мг пятен крови на марле в агглю-тинационных пробирках нагревали, охлаждали, подвергали действию ультрафиолетовых и инфракрасных лучей, ультразвука, обработке мылом.

Применяли 2 вида нагревания: в термостате при +63°; 15, 30 и 60 мин., 6, 12 и 24 часа; при +100°: 15, 30 и 60 мин.; при +140°: 15 и 30 мин.

В водяной бане при +63°: 15, 30 и 60 мин., 6 и 12 часов. В водяную баню пятна помещали не в пробирках, а в открытых чашках Петри, плававших на поверхности воды.

Охлаждение пятен до —1° проводили в комнатном холодильнике ЗИЛ 1, 6, 12 и 24 часа.

В качестве источника ультрафиолетовых лучей применяли аппарат для люминесцентной диагностики (модель 011) с вмонтированной ртутно-кварцевой горелкой типа ПРК-4 и светофильтром УФС-3, пропускающим ультрафиолетовые лучи длиной волны 360 ммк. Пятна в пробирках помещали на расстоянии 75 см от горелки и облучали 15, 30 и 60 мин.

Инфракрасное облучение производили лампой KSL J 250 W, излучающей лучи с длиной волны 0, 7—1, 4 мк. Пробирки с навесками кровяных пятен располагали на расстоянии 35 см от лампы, чем достигался температурный эффект +35°, время воздействия— 15, 30 и 60 мин.

Ультразвук получали от малогабаритного импульсного ультразвукового дефектоскопа УЗДЛ-61 с питанием от аккумуляторной батареи с напряжением 24 в. Усилитель импульсов настраивали на частоту 2, 5 мгц. Пробирки с измельченным материалом помещали на поверхность призмы и подвергали воздействию ультразвуком 3, 15, 30 и 60 мин. В пробирки непосредственно перед опытом в целях создания лучших условий для проникновения ультразвуковых волн наливали 0, 2 мл физиологического раствора.

Воздействие мылом. На 20 мг материала пятна крови закапывали 2 капли подогретого 20% раствора мыла, оставляли при комнатной температуре для высыхания мыла, а затем из пятна приготовляли вытяжку.

В каждой серии опытов брали 2—4 пятна разновидности Gm (а + ) и 2 пятна —Gm (а—). Непосредственно после воздействия на материал одним из перечисленных методов пятно заливали 0, 2 мл физиологического раствора (при воздействии ультразвуком физиологический раствор помещали в пробирки перед опытом), экстрагировали при 4° в течение 24 часов. Отдельные вытяжки из пятен разновидности Gm (а + ) в каждой серии разводили в кратном соотношении до 1: 128. В вытяжках и их разведениях определяли фактор Gm(a).

Все перечисленные выше виды внешнего воздействия, за исключением мыла, не влияли на результаты определения фактора Gm(a). Даже продолжительное нагревание до 100—140°, значительно превышающее температуру, при которой происходит денатурация белков в растворе, не нарушило проявление тормозных свойств. Наблюдаемые колебания в тормозной способности вытяжек в пределах 2—3 ступеней разведений, по-видимому, объясняются неравномерным распределением сывороточного белка в пятне. При нагревании в водяной бане пятна подвергались воздействию водяного пара, причем на дне чашки Петри скапливалась вода, в которой растворялась часть крови из пятна. Несмотря на такие, казалось бы, очень неблагоприятные условия, снижения тормозной способности разведений вытяжек из пятен крови, нагревавшихся в водяной бане, практически не произошло.

Из всех видов внешнего воздействия, испробованных нами, лишь мыло нарушило возможность определения фактора Gm(a): агглютинация сенсибилизированных эритроцитов под воздействия антител анти-Gm^a не происходила. Для изучения этого явления был проделан контрольный опыт. Для этого 10% раствор мыла разводили физиологическим раствором в кратном соотношении до 1: 256. Одну каплю сыворотки анти-Gm^a на плексигласовой пластинке с дорожками смешивали с каплей одного из разведений мыла, а затем добавляли каплю сенсибилизированных эритроцитов. Пластинку с реагентами помещали во влажную камеру. Результаты реакции учитывали через 1 час. Ожидаемая агглютинация сенсибилизированных эритроцитов не произошла в присутствии исходного раствора мыла, а также его разведений 1: 2— 1: 32. На дорожках с разведениями мыла 1: 64 и 1: 128 различалась нестойкая агглютинация эритроцитов, а с разведением мыла 1: 256 — слабо выраженная агглютинация эритроцитов. Смесь реагентов пастеровскими пипетками переносили на предметные стекла и рассматривали под микроскопом. Под воздействием исходного раствора мыла, а также разведений 1: 2—1: 16 произошел полный гемолиз эритроцитов, последние под микроскопом не были видны. Эритроциты, взаимодействовавшие с разведением мыла 1: 32, также подверглись гемолизу и под микроскопом имели вид бледных теней. Разведения мыла 1: 64—1: 258 не вызвали заметного гемолиза эритроцитов при рассматривании под микроскопом. Таким образом, щелочи, входящие в состав мыла, при непосредственном добавлении к реагентам мешают установлению фактора Gm (а), вызывая гемолиз сенсибилизированных эритроцитов.

В стремлении приблизить опыты к естественным условиям поставили следующий эксперимент: 4 навески по 50 мг пятен на марле [из них в 3 навесках кровь группы Gm(a + ), в 1 навеске — группы Gm(a—)] поместили в чашки Петри. Последние, не закрывая крышками, выставили летом на 7 дней на улицу. Первые 3 дня стояла жаркая сухая погода, пятна ежедневно по 7—10 часов подвергались действию прямых солнечных лучей. На 4-й день пятна 5 часов находились под дождем. После окончания дождя из чашек Петри была лишь удалена дождевая вода. В последующие дни погода была пасмурной, сырой, экспериментальный материал не высыхал. После описанного воздействия кровь из пятен в холодильнике экстрагировали 24 часа в 0, 3 мл физиологического раствора. Вытяжки имели бледно-желтую окраску. При исследовании 3 вытяжки из пятен группы Gm(a + ) показали отчетливую тормозную реакцию. Вытяжка из пятна группы Gm(a—) не влияла на агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, установлено, что фактор Gm(a) в сухой крови устойчив к внешним воздействиям, не чувствителен к колебаниям температуры, не разрушается под действием ультрафиолетовых и инфракрасных лучей, ультразвука.

Обладая устойчивостью к длительному хранению и к различным внешним воздействиям, он служит группоспецифическим признаком для экспертного установления в пятнах крови. Метод обнаружения ГАММА-глобулинового фактора в вытяжках из пятен крови достаточно чувствителен. Частота распределения его у лиц русской национальности благоприятствует широкому использованию его в судебно-медицинской практике.

¹ Gm-разновидности крови в вытяжках из пятен определяли по методике, описанной нами (Суд.-мед. экспертиза, 1963, № 3, с. 38—42).